علیحدگی گلو کا استعمال کیسے کریں؟
مغربی دھبے کی جھلی کی منتقلی
کرنٹ کی کارروائی کے تحت، پروٹین کو جیل سے ٹھوس کیریئر (جھلی) میں منتقل کیا جاتا ہے۔
جھلی کا انتخاب: امپرنٹنگ میں عام طور پر استعمال ہونے والے ٹھوس مرحلے والے مواد میں NC جھلی، DBM، DDT، نایلان جھلی، PVDF وغیرہ شامل ہیں۔ ہم PVDF (پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ) کا انتخاب کرتے ہیں، جس میں پروٹین جذب، جسمانی طاقت اور بہتر کیمیائی مطابقت ہوتی ہے۔دو وضاحتیں ہیں: immobilon-p (0.45um) اور immobilon PSQ (0.2um for MW <20kDa)۔
نیم خشک طریقہ
یعنی، جیل انٹرلیئر کا امتزاج فلٹر پیپر کے درمیان ٹرانسفر بفر کے ساتھ رکھا جاتا ہے، اور ٹرانسفر اثر کو حاصل کرنے کے لیے فلٹر پیپر پر جذب شدہ بفر کے ذریعے کرنٹ چلایا جاتا ہے۔چونکہ موجودہ فلم گلو پر براہ راست کام کرتا ہے، منتقلی کے حالات نسبتاً سخت ہیں، لیکن منتقلی کا وقت کم ہے اور کارکردگی زیادہ ہے۔
(1) تجرباتی حالات کا انتخاب
کرنٹ 1ma-2ma/cm2 ہے، اور ہم عام طور پر 100mA/membrane استعمال کرتے ہیں۔منتقلی کا وقت ہدف پروٹین مالیکیول کے سائز اور جیل کی حراستی کے مطابق منتخب کیا جا سکتا ہے، اور اصل صورت حال کے مطابق مناسب طریقے سے ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔
ہدف پروٹین مالیکیولر سائز (kDa)، جیل کی حراستی اور منتقلی کا وقت
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15-40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) تجرباتی آپریشن
(1) فلٹر پیپر اور جھلی کی تیاری (الیکٹروفورسس سے 20 منٹ پہلے تیاری شروع کی جائے گی)۔
A. چیک کریں کہ آیا کافی ٹرانسفر بفرز ہیں، جو فوری طور پر تیار نہیں ہوئے ہیں۔
B. چیک کریں کہ آیا فلٹر پیپر اور مناسب سائز کی جھلی موجود ہے۔
C. جھلی کو میتھانول میں تقریباً 1-2 منٹ تک ڈبو دیں۔اور پھر ٹرانسفر بفر میں منتقل کر دیا گیا۔
D. مناسب چپکنے والے فلٹر پیپر اور میمبرین فلٹر پیپر کو بالترتیب ٹرانسفر بفر میں بھگو دیں۔
ٹرانسفر بفر میں داخل ہوتے وقت پی ڈی وی ایف جھلی کو میتھانول میں کتنی دیر تک بھگونا چاہیے؟
PVDF ہائیڈروفوبک ہے، اور منتقلی بفر میں لینا مشکل ہے۔میتھانول کے علاج کے بعد، اسے لینا آسان ہے.PVDF کا پہلے سے علاج یہ ہے کہ اسے میتھانول کے ساتھ بھگو کر چالو کریں، اور پھر اسے اچھی طرح بھگونے کے بعد آست پانی سے دو بار دھو لیں۔میتھانول کے بلبلوں کو استعمال کرنے کا مقصد PVDF جھلی پر مثبت چارج شدہ گروپوں کو چالو کرنا اور منفی چارج شدہ پروٹین کے ساتھ باندھنا آسان بنانا ہے۔
لوگ اسے عام طور پر 5-20 منٹ تک استعمال کرتے ہیں۔اسے گوند لینے کے ساتھ ہی بھگویا جا سکتا ہے، اور اندازہ ہے کہ اس میں تقریباً 5 منٹ لگیں گے۔اثر برا نہیں ہے۔ماضی میں، کچھ ویب فرینڈز نے پوسٹ کیا کہ پروسیسنگ کے وقت میں زیادہ فرق نہیں پڑتا، لیکن کلیدی فلم کا معیار تھا۔یہ سچ ہے.جب تک جھلی مکمل طور پر بھیگی ہے، یہ ٹھیک ہونا چاہئے.
Hybond کی PVDF تفصیلات اس طرح پڑھتی ہیں: "100% میٹانول (10 سیکنڈ) میں جھلی کو پہلے سے گیلی کر دیں"۔میری سمجھ یہ ہے کہ کم از کم 10 سیکنڈ تک بھگونا ٹھیک ہے۔درحقیقت، 10 سیکنڈ یا 10 منٹ تک بھگو دینا ٹھیک ہے۔
(2) منتقلی
A. الیکٹرک ٹرانسفر کے آلے پر نچلا فلٹر پیپر بچھائیں۔عام طور پر تین پرتیں استعمال ہوتی ہیں۔
B. جھلی کو فلٹر پیپر پر جھلی کے خلاف رکھیں، اس بات پر توجہ دیں کہ جھلی اور فلٹر پیپر کے درمیان بلبلے نہ ہوں، اور جھلی کو گیلا رکھنے کے لیے جھلی پر کچھ ٹرانسفر بفر ڈالیں۔
C. گلو کو چھیلیں، اسٹیک جیل کو ہٹا دیں اور احتیاط سے اسے فلم پر منتقل کریں۔
D. فلم کے اوپری بائیں کونے کو کاٹ دیں اور پنسل سے فلم پر گلو کی پوزیشن کو نشان زد کریں۔
E. فلٹر پیپر کا ایک ٹکڑا گلو پر لگے گوند کے خلاف ڈھانپیں۔کچھ ٹرانسفر بفر ڈالیں اور فلٹر پیپر کے دو ٹکڑے بچھا دیں۔
F. بجلی کی منتقلی کے آلے کو انسٹال کریں اور ضروریات کے مطابق مطلوبہ کرنٹ اور وقت کا انتخاب کریں۔
G. منتقلی کے عمل کے دوران، وولٹیج کی تبدیلی کسی بھی وقت دیکھی جائے گی، اور کسی بھی غیر معمولی کو وقت پر ایڈجسٹ کیا جائے گا۔
پوسٹ ٹائم: ستمبر 07-2022
