如何使用分离胶？
蛋白质印迹膜转移
在电流的作用下，蛋白质从凝胶转移到固体载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等，我们选择PVDF（聚偏氟乙烯），它具有更好的蛋白质吸附性、物理强度和更好的化学相容性。有两种规格：immobilon-p (0.45um) 和 immobilon PSQ (0.2um for MW < 20kDa)。
一种半干法
即凝胶夹层组合置于带有转印缓冲液的滤纸之间，通过吸附在滤纸上的缓冲液传导电流，从而达到转印效果。由于电流直接作用在薄膜胶上，转印条件比较苛刻，但转印时间短，效率高。
(1)实验条件的选择
电流为1ma-2ma/cm2，我们一般用100mA/膜。转印时间可根据目的蛋白分子大小和凝胶浓度选择，并可根据实际情况适当调整。
目标蛋白分子大小 (kDa)、凝胶浓度和转移时间
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) 实验操作
(1)滤纸和滤膜的准备(电泳前20分钟开始准备)。
A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即准备好。
B、检查是否有尺寸合适的滤纸和滤膜。
C. 将膜浸入甲醇中约 1-2 分钟。然后转移到转移缓冲区。
D. 将合适的粘性滤纸和膜滤纸分别浸入转移缓冲液中。
PDVF 膜在进入转印缓冲液时应在甲醇中浸泡多长时间？
PVDF 是疏水性的，很难浸泡在转移缓冲液中。经过甲醇处理后，更容易浸泡。PVDF的前处理是先用甲醇浸泡活化，浸泡彻底后用蒸馏水洗涤两次。使用甲醇气泡的目的是激活 PVDF 膜上带正电荷的基团，使其更容易与带负电荷的蛋白质结合。
人们通常使用它 5-20 分钟。可以和取胶水同时浸泡，估计需要5分钟左右。效果还不错。以前有网友发帖说处理时间不是很重要，关键是片子的质量。这是真的。只要膜完全浸湿，就可以了。
Hybond 的 PVDF 规格如下：“在 100% 甲醇中预润湿膜（10 秒）”。我的理解是至少浸泡10秒就可以了。其实泡10秒、10分钟就可以了。
(2) 转移
A. 将下层滤纸放在电转移仪上。一般采用三层。
B. 将膜靠在滤纸上，注意膜与滤纸之间不要有气泡，并在膜上倒一些转移缓冲液以保持膜湿润。
C. 撕掉胶水，取出堆叠凝胶并小心地将其移到薄膜上。
D、将薄膜的左上角剪掉，用铅笔在薄膜上标出涂胶位置。
E、盖一张滤纸抵住胶水上的胶水。倒入一些转移缓冲液并放置两张滤纸。
F、安装电转换仪，根据需要选择需要的电流和时间。
G、转运过程中，应随时观察电压变化，发现异常及时调整。
发布时间：Sep-07-2022
