Kif tuża kolla ta 'separazzjoni?– parti 1

Kif tuża kolla ta 'separazzjoni?

Trasferiment tal-membrana Western blot

Taħt l-azzjoni tal-kurrent, il-proteina tiġi trasferita mill-ġell għat-trasportatur solidu (membrana).

Għażla tal-membrana: il-materjali ta 'fażi solida użati b'mod komuni fl-imprinting jinkludu membrana NC, DBM, DDT, membrana tan-najlon, PVDF, eċċ Aħna nagħżlu PVDF (fluworidu tal-polyvinylidene), li għandu assorbiment aħjar tal-proteini, saħħa fiżika u kompatibilità kimika aħjar.Hemm żewġ speċifikazzjonijiet: immobilon-p (0.45um) u immobilon PSQ (0.2um għal MW < 20kDa).

Metodu semi niexef

Jiġifieri, il-kombinazzjoni tas-saff tal-ġell titqiegħed bejn il-karta tal-filtru mal-buffer tat-trasferiment, u l-kurrent jitmexxa permezz tal-buffer adsorbit fuq il-karta tal-filtru biex jinkiseb l-effett tat-trasferiment.Minħabba li l-kurrent jaġixxi direttament fuq il-kolla tal-film, il-kundizzjonijiet tat-trasferiment huma relattivament ħarxa, iżda l-ħin tat-trasferiment huwa qasir u l-effiċjenza hija għolja.

(1) għażla ta 'kundizzjonijiet sperimentali

Il-kurrent huwa 1ma-2ma / cm2, u ġeneralment nużaw 100mA / membrana.Il-ħin tat-trasferiment jista 'jintgħażel skont id-daqs tal-molekula tal-proteina fil-mira u l-konċentrazzjoni tal-ġel, u jista' jiġi aġġustat b'mod xieraq skont is-sitwazzjoni attwali.

Id-daqs molekulari tal-proteina fil-mira (kDa), il-konċentrazzjoni tal-ġel u l-ħin tat-trasferiment

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) operazzjoni sperimentali

(1) Preparazzjoni ta 'karta tal-filtru u membrana (il-preparazzjoni għandha tinbeda 20 minuta qabel l-elettroforeżi).

A. Iċċekkja jekk hemmx biżżejjed buffers ta 'trasferiment, li mhumiex ippreparati immedjatament.

B. Iċċekkja jekk hemmx karta tal-filtru u membrana ta 'daqs xieraq.

C. Għaddas il-membrana fil-metanol għal madwar 1-2 minuti.U mbagħad trasferiti għall-buffer tat-trasferiment.

D. Xarrab il-karta tal-filtru adeżiva xierqa u l-karta tal-filtru tal-membrana fil-buffer tat-trasferiment rispettivament.

Kemm għandha ddum il-membrana PDVF tixxarrab fil-metanol meta tidħol fil-buffer tat-trasferiment?

PVDF huwa idrofobiku, u huwa diffiċli li tixxarrab fil-buffer tat-trasferiment.Wara t-trattament tal-metanol, huwa aktar faċli li tixxarrab.It-trattament minn qabel tal-PVDF huwa li jixxarrab u jattivah bil-metanol, u mbagħad aħsel darbtejn b'ilma distillat wara t-tixrib sewwa.L-iskop tal-użu tal-bżieżaq tal-metanol huwa li jattiva l-gruppi ċċarġjati b'mod pożittiv fuq il-membrana PVDF u jagħmilha aktar faċli biex jorbot ma 'proteini ċċarġjati b'mod negattiv.

In-nies normalment jużawha għal 5-20 minuta.Jista 'jiġi mxarrba fl-istess ħin li tieħu l-kolla, u huwa stmat li se tieħu madwar 5 minuti.L-effett mhuwiex ħażin.Fil-passat, xi ħbieb tal-web stazzjonati li l-ħin tal-ipproċessar ma tantx kien importanti, iżda ċ-ċavetta kienet il-kwalità tal-film.Veru.Sakemm il-membrana tkun kompletament mxarrba, għandha tkun OK.

L-ispeċifikazzjoni tal-PVDF ta 'Hybond taqra kif ġej: "imxarrab minn qabel il-membrana f'100% metanol (10 sekondi)".Il-fehim tiegħi huwa li huwa tajjeb li tixxarrab għal mill-inqas 10 sekondi.Fil-fatt, huwa tajjeb li tixxarrab għal 10 sekondi jew 10 minuti.

(2) Trasferiment

A. Poġġi l-karta tal-filtru t'isfel fuq l-istrument tat-trasferiment elettriku.Ġeneralment jintużaw tliet saffi.

B. Poġġi l-membrana fuq il-karta tal-filtru kontra l-membrana, oqgħod attent li ma jkollokx bżieżaq bejn il-membrana u l-karta tal-filtru, u ferra xi buffer ta 'trasferiment fuq il-membrana biex iżżomm il-membrana mxarrba.

C. Qaxxar il-kolla, neħħi l-ġell tal-munzell u ċċaqlaqha bir-reqqa fuq il-film.

D. Aqta 'l-kantuniera ta' fuq tax-xellug tal-film u mmarka l-pożizzjoni tal-kolla fuq il-film b'lapes.

E. Għatti biċċa karta tal-filtru kontra l-kolla fuq il-kolla.Ferra xi transfer buffer u poġġi żewġ biċċiet tal-karta tal-filtru.

F. Installa l-istrument tat-trasferiment elettriku u agħżel il-kurrent u l-ħin meħtieġa skond il-ħtiġijiet.

G. Matul il-proċess ta 'trasferiment, il-bidla fil-vultaġġ għandha tiġi osservata fi kwalunkwe ħin, u kwalunkwe anormalità għandha tiġi aġġustata fil-ħin.