분리 접착제를 사용하는 방법?- 1 부

분리 접착제를 사용하는 방법?

웨스턴 블롯 막 전달

전류의 작용 하에 단백질은 겔에서 고체 담체(막)로 옮겨집니다.

멤브레인 선택: 임프린팅에서 일반적으로 사용되는 고상 재료에는 NC 멤브레인, DBM, DDT, 나일론 멤브레인, PVDF 등이 포함됩니다. 우리는 더 나은 단백질 흡착, 물리적 강도 및 더 나은 화학적 호환성을 가진 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드)를 선택합니다.immobilon-p(0.45um) 및 immobilon PSQ(MW < 20kDa의 경우 0.2um)의 두 가지 사양이 있습니다.

반건조 방식

즉, 겔 중간층 조합을 전사 버퍼가 있는 여과지 사이에 놓고, 여과지에 흡착된 버퍼를 통해 전류를 전도하여 전사 효과를 달성한다.전류가 필름 접착제에 직접 작용하기 때문에 전사 조건은 비교적 가혹하지만 전사 시간이 짧고 효율이 높습니다.

(1) 실험 조건의 선택

전류는 1ma-2ma / cm2이며 일반적으로 100mA / 멤브레인을 사용합니다.이송 시간은 표적 단백질 분자의 크기 및 겔 농도에 따라 선택될 수 있으며, 실제 상황에 따라 적절하게 조정될 수 있다.

표적 단백질 분자 크기(kDa), 겔 농도 및 전달 시간

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15-40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) 실험적 조작

(1) 여과지 및 멤브레인의 준비(준비는 전기영동 20분 전에 시작한다).

A. 즉시 준비되지 않은 전송 버퍼가 충분한지 확인하십시오.

나. 적당한 크기의 여과지와 막이 있는지 확인한다.

C. 멤브레인을 메탄올에 약 1-2분 동안 담급니다.그런 다음 전송 버퍼로 전송됩니다.

D. 적절한 점착성 여과지와 멤브레인 여과지를 각각 transfer buffer에 담급니다.

전송 버퍼에 들어갈 때 PDVF 멤브레인을 메탄올에 얼마나 오래 담가야 합니까?

PVDF는 소수성이며 전송 버퍼에 담그기 어렵습니다.메탄올 처리 후 담그기가 더 쉽습니다.PVDF의 전처리는 메탄올에 담가 활성화시킨 후 충분히 담근 후 증류수로 2회 세척하는 것이다.메탄올 기포를 사용하는 목적은 PVDF 멤브레인의 양전하 그룹을 활성화하고 음전하 단백질과 더 쉽게 결합하도록 만드는 것입니다.

사람들은 보통 5-20분 동안 사용합니다.글루를 복용함과 동시에 담글 수 있으며 약 5분 정도 소요될 것으로 예상됩니다.효과는 나쁘지 않습니다.예전에 어떤 웹친구들은 처리 시간은 별로 중요하지 않지만 핵심은 필름의 품질이었다고 게시했습니다.사실입니다.막이 완전히 스며들면 괜찮을 것입니다.

Hybond의 PVDF 사양은 다음과 같습니다.내 이해는 적어도 10초 동안 담가도 괜찮다는 것입니다.사실 10초 또는 10분 동안 담가도 괜찮습니다.

(2) 이송

A. 전기이동기에 하부여과지를 깔아준다.일반적으로 3개의 레이어가 사용됩니다.

B. 멤브레인을 여과지 위에 멤브레인에 대고 놓고 멤브레인과 여과지 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하고 약간의 이동 완충액을 멤브레인에 부어 멤브레인이 젖도록 합니다.

C. 접착제를 벗겨내고 스택 젤을 제거한 다음 조심스럽게 필름 위로 옮깁니다.

D. 필름의 왼쪽 상단 모서리를 잘라내고 필름에 접착제 위치를 연필로 표시합니다.

E. 접착제의 접착제에 대해 여과지 조각을 덮습니다.약간의 이동 완충액을 붓고 여과지 두 장을 깔아줍니다.

F. 전기 이송 기구를 설치하고 필요에 따라 필요한 전류와 시간을 선택한다.

G. 이송 과정에서 전압 변화를 수시로 관찰하고 이상이 있으면 적시에 조정해야 합니다.