Pehea e hoʻohana ai i ke kāpili hoʻokaʻawale?- ʻāpana 1

Pehea e hoʻohana ai i ke kāpili hoʻokaʻawale?

Ka hoʻoili ʻana o ka membrane blot Western

Ma lalo o ka hana o kēia manawa, hoʻoneʻe ʻia ka protein mai ka gel i ka mea lawe paʻa (membrane).

Membrane koho: ka mea maʻamau i hoʻohana paʻa-phase mea i imprinting me NC membrane, DBM, DDT, nylon membrane, PVDF, etc. makou koho PVDF (polyvinylidene fluoride), i oi aku ka protein adsorption, kino ikaika a me ka maikai kemikala like.ʻElua mau kikoʻī: immobilon-p (0.45um) a me immobilon PSQ (0.2um no MW <20kDa).

ʻO kahi ʻano semi maloʻo

ʻO ia hoʻi, hoʻokomo ʻia ka hui ʻana o ka gel interlayer ma waena o ka pepa kānana me ka buffer hoʻoili, a ke alakaʻi ʻia nei kēia manawa ma o ka buffer adsorbed ma ka pepa kānana e hoʻokō i ka hopena hoʻololi.Ma muli o ka hana pololei ʻana o kēia manawa ma ke kāpili kiʻiʻoniʻoni, ʻoi aku ka paʻakikī o nā kūlana hoʻoili, akā pōkole ka manawa hoʻololi a kiʻekiʻe ka pono.

(1) koho i nā kūlana hoʻokolohua

ʻO 1ma-2ma / cm2 kēia manawa, a hoʻohana pinepine mākou i ka 100mA / membrane.Hiki ke koho ʻia ka manawa hoʻololi e like me ka nui o ka molela protein target a me ka ʻike gel, a hiki ke hoʻoponopono kūpono ʻia e like me ke kūlana maoli.

ʻO ka nui o ka molecular protein target (kDa), ka hoʻopaʻa ʻana o ka gel a me ka manawa hoʻololi

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) hana hoʻokolohua

(1) Hoʻomākaukau i ka pepa kānana a me ka membrane (e hoʻomaka ka hoʻomākaukau ʻana i 20 mau minuke ma mua o ka electrophoresis).

A. E nānā inā lawa nā pale hoʻoili, ʻaʻole i hoʻomākaukau koke ʻia.

B. E nānā inā he pepa kānana a me ka membrane o ka nui kūpono.

C. E hoʻokomo i ka membrane i loko o ka methanol no kahi o 1-2 mau minuke.A laila ua hoʻoili ʻia i ka hoʻoili paʻa.

D. E hoʻomoʻa i ka pepa kānana hoʻopili kūpono a me ka pepa kānana membrane i loko o ka pahu hoʻololi.

Pehea ka lōʻihi o ke komo ʻana o ka membrane PDVF i ka methanol i ke komo ʻana i ka pahu hoʻoili?

He hydrophobic ka PVDF, a he mea paʻakikī ke komo i loko o ka pahu hoʻololi.Ma hope o ka mālama ʻana i ka methanol, ʻoi aku ka maʻalahi o ka pulu.ʻO ka hoʻomaʻamaʻa mua ʻana o ka PVDF, ʻo ia ka hoʻoulu ʻana a me ka hoʻōla ʻana me ka methanol, a laila holoi ʻelua me ka wai maʻemaʻe ma hope o ka hoʻomaloʻo ʻana.ʻO ke kumu o ka hoʻohana ʻana i nā ʻōpū methanol e hoʻāla i nā pūʻulu i hoʻopiʻi maikaʻi ʻia ma ka membrane PVDF a maʻalahi i ka hoʻopaʻa ʻana me nā protein i hoʻopiʻi maikaʻi ʻia.

Hoʻohana maʻamau ka poʻe no 5-20 mau minuke.Hiki ke hoʻoluʻu i ka manawa like me ka lawe ʻana i ke kāpili, a ua manaʻo ʻia he 5 mau minuke.ʻAʻole maikaʻi ka hopena.I ka wā ma mua, ua hoʻopuka kekahi mau hoaaloha pūnaewele ʻaʻole i pili nui ka manawa hana, akā ʻo ke kī ke ʻano o ke kiʻiʻoniʻoni.ʻOiaʻiʻo.I ka wā e hoʻopiha piha ʻia ka membrane, pono ia e OK.

Heluhelu ʻia ka ʻōlelo kikoʻī PVDF o Hybond penei: "hoʻomaʻemaʻe i ka membrane i 100% metanol (10 kekona)".ʻO koʻu hoʻomaopopo ʻana he mea maikaʻi ke hoʻoinu no 10 mau kekona.ʻO ka ʻoiaʻiʻo, ʻoi aku ka maikaʻi o ka wai no 10 kekona a i ʻole 10 mau minuke.

(2) Hoʻololi

A. E kau i ka pepa kānana haʻahaʻa ma luna o ka mea hoʻoili uila.ʻO ka maʻamau, hoʻohana ʻia ʻekolu papa.

B. E kau i ka membrane ma luna o ka pepa kānana e kū'ē i ka membrane, e makaʻala i ʻole e loaʻa nā ʻōhū ma waena o ka membrane a me ka pepa kānana, a ninini i kahi pale hoʻololi ma luna o ka membrane e hoʻomaʻemaʻe i ka membrane.

C. Peel i ke kāpili, wehe i ka pahu pahu a neʻe pono ma luna o ke kiʻiʻoniʻoni.

D. Eʻoki i kaʻaoʻao hema hema o ka kiʻiʻoniʻoni a kaha i ke kūlana glue ma ke kiʻi me kahi penikala.

E. E uhi i kahi ʻāpana pepa kānana e pili ana i ke kolu ma ke kāpili.E ninini i kahi pahu hoʻololi a waiho i ʻelua ʻāpana pepa kānana.

F. E hoʻouka i ka mea hoʻoili uila a koho i ka manawa a me ka manawa e pono ai e like me nā pono.

G. I ka wā o ka hoʻololi ʻana, e ʻike ʻia ka hoʻololi ʻana o ka volta i kēlā me kēia manawa, a e hoʻoponopono ʻia nā mea ʻino i ka manawa.