विभाजन गोंद कसरी प्रयोग गर्ने?- भाग 1

विभाजन गोंद कसरी प्रयोग गर्ने?

पश्चिमी धब्बा झिल्ली स्थानान्तरण

वर्तमानको कार्य अन्तर्गत, प्रोटीन जेलबाट ठोस वाहक (झिल्ली) मा हस्तान्तरण गरिएको छ।

झिल्ली छनोट: प्रिन्टिङमा सामान्यतया प्रयोग हुने ठोस-फेज सामग्रीहरूमा NC झिल्ली, DBM, DDT, नायलॉन झिल्ली, PVDF, आदि समावेश छन्। हामीले PVDF (पोलिभिनिलिडेन फ्लोराइड) छनोट गर्छौं, जसमा राम्रो प्रोटीन शोषण, शारीरिक बल र राम्रो रासायनिक अनुकूलता हुन्छ।त्यहाँ दुई विनिर्देशहरू छन्: immobilon-p (0.45um) र immobilon PSQ (MW <20kDa को लागि 0.2um)।

अर्ध सुक्खा विधि

त्यो हो, जेल इन्टरलेयर संयोजन ट्रान्सफर बफरको साथ फिल्टर पेपरको बीचमा राखिएको छ, र हाललाई ट्रान्सफर प्रभाव प्राप्त गर्न फिल्टर पेपरमा सोस्ने बफर मार्फत सञ्चालन गरिन्छ।हालको फिलिम ग्लुमा सीधा कार्य गर्ने कारण, स्थानान्तरण अवस्थाहरू अपेक्षाकृत कठोर छन्, तर स्थानान्तरण समय छोटो छ र दक्षता उच्च छ।

(1) प्रयोगात्मक अवस्थाहरूको चयन

वर्तमान 1ma-2ma / cm2 हो, र हामी सामान्यतया 100mA / झिल्ली प्रयोग गर्छौं।स्थानान्तरण समय लक्ष्य प्रोटीन अणु र जेल एकाग्रता को आकार अनुसार चयन गर्न सकिन्छ, र वास्तविक स्थिति अनुसार उचित समायोजन गर्न सकिन्छ।

लक्ष्य प्रोटीन आणविक आकार (kDa), जेल एकाग्रता र स्थानान्तरण समय

८०---१४० ८% १.५-२.०

२५---८० १०% १.५

१५–४० १२% ०.७५

<20 15% 0.5

(2) प्रयोगात्मक सञ्चालन

(१) फिल्टर पेपर र झिल्लीको तयारी (तयारी इलेक्ट्रोफोरेसिस भन्दा २० मिनेट अघि सुरु गर्नुपर्छ)।

A. त्यहाँ पर्याप्त स्थानान्तरण बफरहरू छन् कि छैनन् जाँच गर्नुहोस्, जुन तुरुन्तै तयार छैन।

B. फिल्टर पेपर र उचित आकारको झिल्ली छ कि छैन जाँच गर्नुहोस्।

C. झिल्लीलाई मिथेनोलमा १-२ मिनेटसम्म डुबाउनुहोस्।र त्यसपछि स्थानान्तरण बफरमा स्थानान्तरण गरियो।

D. स्थानान्तरण बफरमा क्रमशः उपयुक्त चिपकने फिल्टर पेपर र झिल्ली फिल्टर पेपर भिजाउनुहोस्।

स्थानान्तरण बफरमा प्रवेश गर्दा PDVF झिल्ली कति लामो मिथानोलमा भिजाउनु पर्छ?

PVDF हाइड्रोफोबिक हो, र यसलाई स्थानान्तरण बफरमा भिजाउन गाह्रो छ।मिथानोल उपचार पछि, यो भिजाउन सजिलो छ।PVDF को पूर्व-उपचार भनेको यसलाई मिथानोलले भिजाउनु र सक्रिय गर्नु हो, र त्यसपछि यसलाई राम्ररी भिजाएर दुई पटक डिस्टिल्ड पानीले धुनुहोस्।मेथानोल बबलहरू प्रयोग गर्नुको उद्देश्य PVDF झिल्लीमा सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका समूहहरूलाई सक्रिय पार्नु र नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका प्रोटीनहरूसँग बाँध्न सजिलो बनाउनु हो।

मानिसहरू सामान्यतया 5-20 मिनेटको लागि प्रयोग गर्छन्।यो गोंद लिँदा एकै समयमा भिजाउन सकिन्छ, र यो लगभग 5 मिनेट लाग्ने अनुमान छ।प्रभाव नराम्रो छैन।विगतमा, केहि वेबफ्रेन्डहरूले पोस्ट गरे कि प्रशोधन समय धेरै फरक पर्दैन, तर मुख्य कुरा फिल्मको गुणस्तर थियो।त्यो सत्य हो।जबसम्म झिल्ली पूर्ण रूपमा भिजेको छ, यो ठीक हुनुपर्छ।

Hybond को PVDF स्पेसिफिकेशन निम्नानुसार पढ्छ: "100% मेटानोल (10 सेकेन्ड) मा झिल्ली पूर्व गीला"।मेरो बुझाइ यो हो कि कम्तिमा 10 सेकेन्डको लागि भिजाउनु ठीक छ।वास्तवमा, यो 10 सेकेन्ड वा 10 मिनेटको लागि भिजाउन ठीक छ।

(२) स्थानान्तरण

A. विद्युतीय स्थानान्तरण उपकरणमा तल्लो फिल्टर पेपर राख्नुहोस्।सामान्यतया तीन तहहरू प्रयोग गरिन्छ।

B. फिल्टर पेपरमा झिल्लीलाई झिल्लीको विरुद्धमा राख्नुहोस्, झिल्ली र फिल्टर पेपरको बीचमा बबलहरू नहोस् भन्ने कुरामा ध्यान दिनुहोस्, र झिल्लीलाई भिजाउनको लागि झिल्लीमा केही स्थानान्तरण बफर खन्याउनुहोस्।

C. ग्लुको छाल हटाउनुहोस्, स्ट्याक जेल हटाउनुहोस् र यसलाई ध्यानपूर्वक फिल्ममा सार्नुहोस्।

D. फिल्मको माथिल्लो बायाँ कुना काट्नुहोस् र पेन्सिलले फिल्ममा ग्लुको स्थिति चिन्ह लगाउनुहोस्।

E. फिल्टर पेपरको टुक्रालाई गोंदमा रहेको ग्लुको विरुद्धमा छोप्नुहोस्।केही स्थानान्तरण बफर हाल्नुहोस् र फिल्टर पेपरको दुई टुक्रा राख्नुहोस्।

F. विद्युतीय स्थानान्तरण उपकरण स्थापना गर्नुहोस् र आवश्यकता अनुसार आवश्यक वर्तमान र समय चयन गर्नुहोस्।

G. स्थानान्तरण प्रक्रियाको बखत, भोल्टेज परिवर्तन कुनै पनि समयमा अवलोकन गरिनेछ, र कुनै पनि असामान्यता समयमा समायोजन गरिनेछ।