E fa'afefea ona fa'aoga kelu vavae?-vaega 1

E fa'afefea ona fa'aoga kelu vavae?

Western blot membrane fesiitaiga

I lalo o le gaioiga o le taimi nei, o le polotini e faʻafeiloaʻi mai le gel i le vaʻa malosi (membrane).

Filifiliga Membrane: o mea e masani ona faʻaogaina i le faʻapipiʻiina e aofia ai le NC membrane, DBM, DDT, nylon membrane, PVDF, ma isi. Matou te filifilia le PVDF (polyvinylidene fluoride), lea e sili atu le adsorption protein, malosi faʻaletino ma sili atu le fetaui lelei o vailaʻau.E lua faʻamatalaga: immobilon-p (0.45um) ma immobilon PSQ (0.2um mo MW <20kDa).

O se auala semi mago

O lona uiga, o le tuʻufaʻatasiga o le gel interlayer e tuʻuina i le va o le pepa faamama ma le paʻu fesiitaiga, ma o le taimi nei e faʻatautaia e ala i le paʻu faʻapipiʻi i luga o le pepa faamama e ausia ai le aafiaga fesiitaiga.Talu ai ona o le taimi nei o loʻo galue saʻo i luga o le kelu ata, o tulaga faʻafeiloaʻi e matua faigata lava, ae o le taimi faʻafeiloaʻi e puupuu ma maualuga le lelei.

(1) filifiliga o tulaga faataitai

O le taimi nei o le 1ma-2ma / cm2, ma e masani ona matou faʻaaogaina le 100mA / membrane.O le taimi fesiitaiga e mafai ona filifilia e tusa ai ma le tele o le mole mole polotini sini ma le faʻaogaina o le gel, ma e mafai ona fetuutuunai talafeagai e tusa ai ma le tulaga moni.

Fuafuaga ole lapo'a mole mole (kDa), fa'asalaina gel ma le taimi e fa'aliliu ai

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) galuega faataitai

(1) Sauniuniga o le pepa faamama ma le membrane (sauniuni e tatau ona amata i le 20 minute aʻo leʻi faia le electrophoresis).

A. Siaki pe o lava le faʻafeiloaʻiga faʻafefe, e leʻi saunia vave.

B. Siaki pe o iai le pepa faamama ma le membrane e talafeagai le lapopoa.

C. Fa'atofu le pa'u ile methanol pe a ma le 1-2 minute.Ona faʻafeiloaʻi atu lea i le faʻafeiloaʻiga faʻafefe.

D. Fa'asusu le pepa faamama fa'apipi'i talafeagai ma le pepa fa'amama membrane i totonu o le pa'u fa'aliliu.

O le a le umi e tatau ai ona susū le pa'u o le PDVF i le methanol pe a ulufale i totonu o le pafe fe'avea'i?

O le PVDF o le hydrophobic, ma e faigata ona faʻafefe i totonu o le faʻafefe faʻafefe.A maeʻa togafitiga o le methanol, e faigofie ona faʻafefe.Ole mua'i togafiti ole PVDF ole fa'asusu ma fa'agaoioi ile methanol, ona fufulu fa'alua lea ile vai fa'amama pe a uma ona fa'asusu lelei.O le faʻamoemoega o le faʻaaogaina o methanol bubbles o le faʻagaoioia o vaega faʻapipiʻi lelei i luga o le PVDF membrane ma faʻafaigofie ona fusifusia i polotini e le lelei.

E masani ona faʻaaogaina e tagata mo le 5-20 minute.E mafai ona susu i le taimi lava e tasi e pei o le aveina o le kelu, ma e faʻatatau e tusa ma le 5 minute e alu ai.E le leaga le aafiaga.I aso ua tuanaʻi, o nisi o uo i luga o le upega tafaʻilagi na faʻasalalau e le afaina tele le taimi o le gaosiga, ae o le ki o le lelei o le ata.E moni lena mea.Afai lava e fa'asusu atoa le membrane, e tatau ona lelei.

O fa'amatalaga PVDF a Hybond e faitauina fa'apea: "mua'i susu le membrane i le 100% metanol (10 sekone)".O lo'u malamalama e le afaina le susu mo le itiiti ifo i le 10 sekone.O le mea moni, e le afaina le susu mo le 10 sekone pe 10 minute.

(2) Faaliliuina

A. Tuu le pepa faamama pito i lalo i luga o le meafaigaluega eletise eletise.E masani ona fa'aaogaina ni fa'afu e tolu.

B. Fa'ata'atia le pa'u i luga o le pepa fa'amama e fa'asaga i le atigipusa, fa'alogo lelei ia aua ne'i i ai ni pupuni i le va o le pa'u ma le pepa fa'amama, ma sasa'a sina pa'u fa'afefe i luga o le pa'u e fa'asusu ai le pa'u.

C. Ave'ese le kelu, aveese le fa'aputu gel ma fa'agasolo lelei i luga o le ata.

D. Oti ese le tulimanu agavale pito i luga o le ata ma faailoga le tulaga kelu i luga o le ata i se penitala.

U. Ufiufi se fasipepa faamama i le kelu i luga o le kelu.Liligi se pa'u fe'avea'i ma tu'u ni fasipepa faamama se lua.

F. Faʻapipiʻi le eletise eletise eletise ma filifili le taimi manaʻomia ma le taimi e tusa ai ma manaʻoga.

G. I le faagasologa o le fesiitaiga, e tatau ona matauina le suiga o le voltage i soʻo se taimi, ma soʻo se mea e le masani ai e tatau ona fetuunai i le taimi.