Ahoana ny fampiasana lakaoly fisarahana?- fizarana 1

Ahoana ny fampiasana lakaoly fisarahana?

Western blot membrane transfert

Eo ambanin'ny hetsika amin'izao fotoana izao, ny proteinina dia nafindra avy amin'ny gel mankany amin'ny mpitatitra mafy (membrane).

Ny fifantenana ny membrane: ny fitaovana matanjaka ampiasaina matetika amin'ny fanontana dia ahitana ny NC membrane, DBM, DDT, nylon membrane, PVDF, sns. Mifidy PVDF (polyvinylidene fluoride) izahay, izay manana adsorption proteinina tsara kokoa, hery ara-batana ary mifanaraka tsara kokoa amin'ny simika.Misy fepetra roa: immobilon-p (0.45um) sy immobilon PSQ (0.2um ho an'ny MW <20kDa).

Fomba semi-dry

Izany hoe, ny gel interlayer fitambarana apetraka eo amin'ny sivana taratasy miaraka amin'ny famindrana buffer, ary ny ankehitriny dia tanterahina amin'ny alalan'ny buffer adsorbed amin'ny taratasy sivana mba hahazoana ny famindrana vokany.Satria ny ankehitriny dia miasa mivantana amin'ny lakaoly sarimihetsika, ny fepetra famindrana dia somary henjana, fa ny fotoana famindrana dia fohy ary ny fahombiazany dia avo.

(1) fifantenana ny fepetra andrana

Ny ankehitriny dia 1ma-2ma / cm2, ary matetika mampiasa 100mA / membrane.Ny fotoana famindrana dia azo voafantina araka ny haben'ny molekiola proteinina kendrena sy ny fifantohana gel, ary azo amboarina araka ny tokony ho izy araka ny zava-misy marina.

Target ny haben'ny molekiola proteinina (kDa), ny fifantohana amin'ny gel ary ny fotoana famindrana

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) asa andrana

(1) Fanomanana ny taratasy sivana sy ny membrane (ny fanomanana dia tokony hatomboka 20 minitra alohan'ny electrophoresis).

A. Jereo raha ampy ny buffer famindrana, izay tsy voaomana avy hatrany.

B. Jereo raha misy taratasy sivana sy fonon-tanana mifanaraka amin'ny habeny.

C. Atsoboka ao anaty methanol mandritra ny 1-2 minitra eo ho eo ny membrane.Ary avy eo dia nafindra tany amin'ny buffer famindrana.

D. Soak ny taratasy adhesive sivana sy ny membrane taratasy sivana ao amin'ny fifindran'ny buffer tsirairay avy.

Hafiriana no tokony hilentika ao anaty methanol ny membrane PDVF rehefa miditra ao amin'ny buffer?

Ny PVDF dia hydrophobic, ary sarotra ny manondraka ao amin'ny buffer famindrana.Aorian'ny fitsaboana methanol dia mora kokoa ny manondraka.Ny fikarakarana mialoha ny PVDF dia ny fandevenana sy fampandehanana azy amin'ny methanol, ary avy eo sasana indroa amin'ny rano voadio rehefa avy natsoboka tsara.Ny tanjona amin'ny fampiasana bubbles methanol dia ny hampavitrika ireo vondrona misy fiampangana tsara ao amin'ny fonon'ny PVDF ary hanamora ny fatorana amin'ny proteinina miiba.

Matetika ny olona no mampiasa azy io mandritra ny 5-20 minitra.Azo alona miaraka amin’ny fakana ny lakaoly izy io, ary heverina fa haharitra 5 minitra eo ho eo izany.Tsy ratsy ny vokany.Taloha, nisy namana web namoaka fa tsy dia misy dikany loatra ny fotoana fikarakarana fa ny kalitaon'ilay sarimihetsika no tena zava-dehibe.Marina izany.Raha mbola levona tanteraka ny membrane dia tokony ho OK.

Ny famaritana PVDF an'ny Hybond dia mivaky toy izao manaraka izao: "alohan'ny mando ny membrane amin'ny metanol 100% (10 segondra)".Ny fahazoako azy dia tsy maninona ny milomano mandritra ny 10 segondra farafahakeliny.Raha ny marina dia tsy maninona ny milomano mandritra ny 10 segondra na 10 minitra.

(2) Famindrana

A. Apetraho eo amin'ny fitaovana fandefasana herinaratra ny taratasy sivana ambany.Amin'ny ankapobeny dia sosona telo no ampiasaina.

B. Apetraho eo amin'ny taratasy fanivanana ny fonon-tanana, tandremo mba tsy hisy bubbles eo anelanelan'ny fonon-tanana sy ny taratasy sivana, ary arotsaho eo amin'ny fonon-tavoahangy ny fonon-tanana mba hitazonana ny membrane ho lena.

C. Esory ny lakaoly, esory ny gel stack ary afindrao tsara eo amin'ny sarimihetsika.

D. Hetezo ny zoro ambony havia amin'ny sarimihetsika ary mariho ny toerana misy ny lakaoly amin'ny sarimihetsika amin'ny pensilihazo.

E. Apetaho amin'ny taratasy sivana iray ny lakaoly eo amin'ny lakaoly.Arotsaka ny buffer famindrana ary apetraho taratasy sivana roa.

F. Apetraho ny fitaovana famindrana herinaratra ary safidio ny ankehitriny sy ny fotoana ilaina araka ny filana.

G. Mandritra ny fizotran'ny famindrana dia tokony hojerena amin'ny fotoana rehetra ny fiovaovan'ny voltase, ary ny tsy mety rehetra dia tokony hamboarina ara-potoana.