¿Cómo usar el pegamento de separación?- parte 1

¿Cómo usar el pegamento de separación?

Transferencia de membrana Western blot

Bajo la acción de la corriente, la proteína se transfiere del gel al soporte sólido (membrana).

Selección de membrana: los materiales de fase sólida comúnmente utilizados en la impresión incluyen membrana NC, DBM, DDT, membrana de nailon, PVDF, etc. Elegimos PVDF (fluoruro de polivinilideno), que tiene una mejor adsorción de proteínas, resistencia física y mejor compatibilidad química.Hay dos especificaciones: immobilon-p (0,45 um) e immobilon PSQ (0,2 um para MW < 20 kDa).

Un método semiseco

Es decir, la combinación de capa intermedia de gel se coloca entre el papel de filtro con el tampón de transferencia y la corriente se conduce a través del tampón adsorbido en el papel de filtro para lograr el efecto de transferencia.Debido a que la corriente actúa directamente sobre el pegamento de la película, las condiciones de transferencia son relativamente duras, pero el tiempo de transferencia es corto y la eficiencia es alta.

(1) selección de condiciones experimentales

La corriente es de 1ma-2ma/cm2, y solemos utilizar 100mA/membrana.El tiempo de transferencia se puede seleccionar según el tamaño de la molécula de proteína objetivo y la concentración del gel, y se puede ajustar adecuadamente según la situación real.

Tamaño molecular de la proteína diana (kDa), concentración de gel y tiempo de transferencia

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operación experimental

(1) Preparación del papel de filtro y la membrana (la preparación debe comenzar 20 minutos antes de la electroforesis).

A. Compruebe si hay suficientes tampones de transferencia, que no se preparan inmediatamente.

B. Verifique si hay papel de filtro y membrana del tamaño adecuado.

C. Sumergir la membrana en metanol durante aproximadamente 1-2 minutos.Y luego transferido al búfer de transferencia.

D. Remoje el papel de filtro adhesivo y el papel de filtro de membrana adecuados en el tampón de transferencia, respectivamente.

¿Cuánto tiempo debe remojarse la membrana de PDVF en metanol cuando ingresa al tampón de transferencia?

El PVDF es hidrofóbico y es difícil sumergirlo en el tampón de transferencia.Después del tratamiento con metanol, es más fácil remojar.El pretratamiento de PVDF consiste en remojarlo y activarlo con metanol, y luego lavarlo dos veces con agua destilada después de remojarlo completamente.El propósito de usar burbujas de metanol es activar los grupos cargados positivamente en la membrana de PVDF y facilitar la unión con proteínas cargadas negativamente.

La gente generalmente lo usa durante 5-20 minutos.Se puede remojar al mismo tiempo que se toma el pegamento, y se estima que tardará unos 5 minutos.El efecto no es malo.En el pasado, algunos amigos de la web publicaron que el tiempo de procesamiento no importaba mucho, pero la clave era la calidad de la película.Eso es cierto.Mientras la membrana esté completamente empapada, debería estar bien.

La especificación de PVDF de Hybond dice lo siguiente: "prehumedecer la membrana en metanol al 100 % (10 segundos)".Tengo entendido que está bien remojar durante al menos 10 segundos.De hecho, está bien remojarlo durante 10 segundos o 10 minutos.

(2) Transferencia

A. Coloque el papel de filtro inferior sobre el instrumento de transferencia eléctrica.Generalmente se utilizan tres capas.

B. Coloque la membrana sobre el papel de filtro contra la membrana, preste atención para que no haya burbujas entre la membrana y el papel de filtro, y vierta un poco de tampón de transferencia sobre la membrana para mantenerla húmeda.

C. Despegue el pegamento, retire el gel de pila y muévalo con cuidado sobre la película.

D. Corte la esquina superior izquierda de la película y marque la posición del pegamento en la película con un lápiz.

E. Cubra un trozo de papel de filtro contra el pegamento en el pegamento.Vierta un poco de tampón de transferencia y coloque dos piezas de papel de filtro.

F. Instale el instrumento de transferencia eléctrica y seleccione la corriente y el tiempo necesarios según las necesidades.

G. Durante el proceso de transferencia, el cambio de voltaje se observará en cualquier momento y cualquier anomalía se ajustará a tiempo.