Jak używać kleju separacyjnego?- Część 1

Jak używać kleju separacyjnego?

Transfer membrany Western blot

Pod wpływem prądu białko jest przenoszone z żelu na stały nośnik (membranę).

Wybór membrany: powszechnie stosowane materiały fazy stałej w imprintingu obejmują membranę NC, DBM, DDT, membranę nylonową, PVDF itp. Wybieramy PVDF (polifluorek winylidenu), który ma lepszą adsorpcję białek, wytrzymałość fizyczną i lepszą kompatybilność chemiczną.Istnieją dwie specyfikacje: immobilon-p (0,45um) i immobilon PSQ (0,2um dla MW < 20kDa).

Metoda półsucha

Oznacza to, że żelową kombinację międzywarstw umieszcza się między bibułą filtracyjną a buforem przenoszącym, a prąd przepływa przez bufor zaadsorbowany na bibule filtracyjnej w celu uzyskania efektu przeniesienia.Ponieważ prąd działa bezpośrednio na klej do folii, warunki transferu są stosunkowo trudne, ale czas transferu jest krótki, a wydajność wysoka.

(1) wybór warunków doświadczalnych

Prąd to 1ma-2ma/cm2, a zwykle używamy 100mA/membranę.Czas transferu można wybrać w zależności od wielkości docelowej cząsteczki białka i stężenia żelu i można go odpowiednio dostosować do aktualnej sytuacji.

Docelowa wielkość cząsteczkowa białka (kDa), stężenie żelu i czas transferu

80 --- 140 8% 1,5-2,0

25 --- 80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operacja eksperymentalna

(1) Przygotowanie bibuły filtracyjnej i membrany (przygotowanie należy rozpocząć 20 minut przed elektroforezą).

A. Sprawdź, czy jest wystarczająca ilość buforów transferowych, które nie są przygotowywane od razu.

B. Sprawdź, czy jest papier filtracyjny i membrana o odpowiednim rozmiarze.

C. Zanurzyć membranę w metanolu na około 1-2 minuty.A następnie przeniesiony do bufora transferowego.

D. Nasącz odpowiednią bibułę filtracyjną z klejem i bibułę filtracyjną z membraną odpowiednio w buforze transferowym.

Jak długo membrana PDVF powinna moczyć się w metanolu przed wejściem do buforu transferowego?

PVDF jest hydrofobowy i trudno go namoczyć w buforze transferowym.Po obróbce metanolem łatwiej jest namoczyć.Wstępna obróbka PVDF polega na namoczeniu i aktywowaniu go metanolem, a następnie dwukrotnym przemyciu wodą destylowaną po dokładnym namoczeniu.Celem zastosowania pęcherzyków metanolu jest aktywacja dodatnio naładowanych grup na membranie PVDF i ułatwienie wiązania z ujemnie naładowanymi białkami.

Ludzie zwykle używają go przez 5-20 minut.Można go namoczyć w tym samym czasie, co pobieranie kleju, a szacuje się, że zajmie to około 5 minut.Efekt nie jest zły.W przeszłości niektórzy znajomi z sieci pisali, że czas przetwarzania nie ma większego znaczenia, ale kluczem jest jakość filmu.To prawda.Dopóki membrana jest całkowicie nasączona, powinno być OK.

Specyfikacja PVDF firmy Hybond brzmi następująco: „wstępnie zwilż membranę w 100% metanolu (10 sekund)”.Rozumiem, że można moczyć przez co najmniej 10 sekund.W rzeczywistości można moczyć przez 10 sekund lub 10 minut.

(2) Przeniesienie

A. Połóż dolną bibułę filtracyjną na elektrycznym przyrządzie do przenoszenia.Zwykle stosuje się trzy warstwy.

B. Połóż membranę na bibule filtracyjnej naprzeciw membrany, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza między membraną a bibułą filtracyjną i wlej trochę buforu transferowego na membranę, aby membrana była mokra.

C. Usuń klej, usuń żel stosu i ostrożnie przenieś go na folię.

D. Odetnij lewy górny róg folii i zaznacz ołówkiem położenie kleju na folii.

E. Przykryj kawałek bibuły filtracyjnej przed klejem na kleju.Wlej trochę buforu transferowego i połóż dwa kawałki bibuły filtracyjnej.

F. Zainstaluj elektryczny przyrząd do przenoszenia i wybierz wymagany prąd i czas zgodnie z potrzebami.

G. Podczas procesu transferu zmiany napięcia należy obserwować w dowolnym momencie, a wszelkie nieprawidłowości należy korygować na czas.