Hvernig á að nota aðskilnaðarlím?
Western blot himnuflutningur
Undir áhrifum straums er próteinið flutt úr hlaupinu yfir í fasta burðarefnið (himnuna).
Himnuval: Algengt er að nota fastfasa efni í áletrun eru NC himna, DBM, DDT, nylon himna, PVDF osfrv. Við veljum PVDF (pólývínýlíden flúoríð), sem hefur betri prótein aðsog, eðlisstyrk og betri efnasamhæfi.Það eru tvær forskriftir: immobilon-p (0,45um) og immobilon PSQ (0,2um fyrir MW < 20kDa).
Hálfþurr aðferð
Það er, hlaup millilagssamsetningin er sett á milli síupappírsins með flutningsbuffinu og straumurinn er leiddur í gegnum biðminni sem er aðsogaður á síupappírinn til að ná flutningsáhrifum.Vegna þess að straumurinn virkar beint á filmulímið eru flutningsskilyrðin tiltölulega erfið, en flutningstíminn er stuttur og skilvirknin mikil.
(1) val á tilraunaskilyrðum
Straumurinn er 1ma-2ma / cm2 og við notum venjulega 100mA / himnu.Hægt er að velja flutningstímann í samræmi við stærð markpróteinsameindarinnar og hlaupstyrkinn og hægt er að stilla hann á viðeigandi hátt í samræmi við raunverulegar aðstæður.
Markmið próteinsameindastærð (kDa), hlaupstyrkur og flutningstími
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) tilraunastarfsemi
(1) Undirbúningur síupappírs og himnu (undirbúningur skal hefjast 20 mínútum fyrir rafskaut).
A. Athugaðu hvort nægir flutningsbuffarar séu til staðar, sem eru ekki tilbúnir strax.
B. Athugaðu hvort til sé síupappír og himna af réttri stærð.
C. Dýfðu himnunni í metanól í um 1-2 mínútur.Og síðan flutt yfir í flutningsbuffið.
D. Leggið viðeigandi límsíupappír og himnusíupappír í bleyti í flutningsjafna, hvort um sig.
Hversu lengi ætti PDVF himnan að liggja í bleyti í metanóli þegar farið er inn í flutningsbuffinn?
PVDF er vatnsfælin og það er erfitt að bleyta í flutningsbuffinu.Eftir metanólmeðferð er auðveldara að liggja í bleyti.Formeðferðin á PVDF er að leggja í bleyti og virkja það með metanóli og þvo það síðan tvisvar með eimuðu vatni eftir vandlega bleyti.Tilgangurinn með því að nota metanólbólur er að virkja jákvætt hlaðna hópa á PVDF himnunni og gera það auðveldara að bindast við neikvætt hlaðin prótein.
Fólk notar það venjulega í 5-20 mínútur.Það má leggja það í bleyti á sama tíma og límið er tekið og er áætlað að það taki um 5 mínútur.Áhrifin eru ekki slæm.Áður fyrr sögðu sumir vefvinir að vinnslutíminn skipti ekki miklu máli, en aðalatriðið væri gæði myndarinnar.Það er satt.Svo lengi sem himnan er alveg í bleyti ætti hún að vera í lagi.
PVDF forskrift Hybond er svohljóðandi: "Forvættu himnuna í 100% metanóli (10 sekúndur)".Mér skilst að það sé í lagi að liggja í bleyti í að minnsta kosti 10 sekúndur.Reyndar er allt í lagi að liggja í bleyti í 10 sekúndur eða 10 mínútur.
(2) Flutningur
A. Leggðu neðri síupappírinn á rafflutningstækið.Almennt eru þrjú lög notuð.
B. Leggðu himnuna á síupappírinn á móti himnunni, passaðu að það komi ekki loftbólur á milli himnunnar og síupappírsins og helltu smá flutningsbuffi á himnuna til að halda himnunni blautu.
C. Fjarlægðu límið, fjarlægðu staflagelið og færðu það varlega yfir á filmuna.
D. Klipptu af efra vinstra horninu á filmunni og merktu límstöðuna á filmunni með blýanti.
E. Hyljið síupappír gegn límið á límið.Hellið smá flutningsbuffi og leggið tvö stykki af síupappír.
F. Settu upp rafflutningstækið og veldu nauðsynlegan straum og tíma í samræmi við þarfir.
G. Meðan á flutningsferlinu stendur skal fylgjast með spennubreytingunni hvenær sem er og allar óeðlilegar breytingar skal lagaðar í tíma.
Pósttími: Sep-07-2022
