Ինչպե՞ս օգտագործել տարանջատող սոսինձ:
Western blot մեմբրանի փոխանցում
Հոսանքի ազդեցության տակ սպիտակուցը գելից տեղափոխվում է պինդ կրիչ (մեմբրան)։
Մեմբրանի ընտրություն. տպագրության մեջ սովորաբար օգտագործվող պինդ փուլային նյութերը ներառում են NC թաղանթ, DBM, DDT, նեյլոնե թաղանթ, PVDF և այլն:Կան երկու բնութագրեր՝ immobilon-p (0.45um) և immobilon PSQ (0.2um ՄՎտ <20kDa-ի համար):
Կիսաչոր մեթոդ
Այսինքն՝ գելային միջշերտային համադրությունը տեղադրվում է ֆիլտրի թղթի միջև՝ փոխանցման բուֆերի հետ, և հոսանքն անցկացվում է ֆիլտրի թղթի վրա ներծծված բուֆերի միջով՝ փոխանցման էֆեկտի հասնելու համար։Քանի որ հոսանքը ուղղակիորեն գործում է ֆիլմի սոսինձի վրա, փոխանցման պայմանները համեմատաբար կոշտ են, բայց փոխանցման ժամանակը կարճ է, իսկ արդյունավետությունը՝ բարձր:
(1) փորձարարական պայմանների ընտրություն
Հոսանքը 1մա-2մա/սմ2 է, և մենք սովորաբար օգտագործում ենք 100մԱ/մեմբրան:Փոխանցման ժամանակը կարող է ընտրվել ըստ թիրախային սպիտակուցի մոլեկուլի չափի և գելի կոնցենտրացիայի և կարող է համապատասխան կերպով ճշգրտվել ըստ իրական իրավիճակի:
Թիրախային սպիտակուցի մոլեկուլային չափը (կԴա), գելի կոնցենտրացիան և փոխանցման ժամանակը
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0,75
<20 15% 0.5
(2) փորձարարական գործողություն
(1) Զտիչ թղթի և թաղանթի պատրաստում (պատրաստումը պետք է սկսվի էլեկտրոֆորեզից 20 րոպե առաջ):
Ա. Ստուգեք, թե արդյոք կան բավարար փոխանցման բուֆերներ, որոնք անմիջապես չեն պատրաստվում:
Բ. Ստուգեք, թե արդյոք կա համապատասխան չափի ֆիլտր թուղթ և թաղանթ:
Գ. Թաղանթն ընկղմեք մեթանոլի մեջ մոտ 1-2 րոպե:Եվ հետո փոխանցվում է փոխանցման բուֆեր:
D. Համապատասխան կպչուն ֆիլտր թուղթը և թաղանթային ֆիլտր թուղթը համապատասխանաբար ներծծում են փոխանցման բուֆերի մեջ:
Որքա՞ն ժամանակ պետք է PDVF թաղանթը ներծծվի մեթանոլի մեջ, երբ մտնում է փոխանցման բուֆեր:
PVDF-ն հիդրոֆոբ է, և դժվար է ներծծվել փոխանցման բուֆերում:Մեթանոլով բուժումից հետո ավելի հեշտ է ներծծվել:PVDF-ի նախնական մշակումն այն է, որ այն թրջել և ակտիվացնել մեթանոլով, այնուհետև մանրակրկիտ թրջվելուց հետո երկու անգամ լվանալ թորած ջրով:Մեթանոլի փուչիկների օգտագործման նպատակն է ակտիվացնել դրական լիցքավորված խմբերը PVDF մեմբրանի վրա և հեշտացնել բացասաբար լիցքավորված սպիտակուցների հետ կապը:
Մարդիկ սովորաբար այն օգտագործում են 5-20 րոպե:Այն կարելի է թրջել սոսինձը վերցնելու հետ միաժամանակ, և ենթադրվում է, որ դա կտևի մոտ 5 րոպե։Էֆեկտը վատ չէ։Նախկինում որոշ վեբ-ընկերներ հրապարակում էին, որ մշակման ժամանակը մեծ նշանակություն չունի, բայց գլխավորը ֆիլմի որակն է:Դա ճիշտ է.Քանի դեռ թաղանթը ամբողջությամբ ներծծված է, այն պետք է լավ լինի:
Hybond-ի PVDF բնութագրում ասվում է հետևյալը.Ես հասկանում եմ, որ նորմալ է ներծծվել առնվազն 10 վայրկյան:Փաստորեն, նորմալ է 10 վայրկյան կամ 10 րոպե թրջելը:
(2) Փոխանցում
Ա. Ներքևի ֆիլտր թուղթը դրեք էլեկտրական փոխանցման գործիքի վրա:Ընդհանուր առմամբ օգտագործվում է երեք շերտ.
Բ. Թաղանթը ֆիլտրի թղթի վրա դրեք թաղանթի վրա, ուշադրություն դարձրեք, որ թաղանթի և ֆիլտրի թղթի միջև փուչիկներ չլինեն, և թաղանթի վրա լցրեք փոխանցման բուֆեր՝ թաղանթը թաց պահելու համար:
Գ. Անջատեք սոսինձը, հեռացրեք կույտի գելը և զգուշորեն տեղափոխեք այն թաղանթի վրա:
Դ. Կտրեք ֆիլմի վերին ձախ անկյունը և մատիտով նշեք ֆիլմի վրա սոսնձի դիրքը:
E. Ծածկեք ֆիլտրի մի կտոր սոսինձի վրա սոսինձի դեմ:Լցնել մի քիչ փոխանցման բուֆեր և դնել երկու կտոր ֆիլտրի թուղթ:
Զ. Տեղադրեք էլեկտրական փոխանցման գործիքը և ընտրեք պահանջվող հոսանքը և ժամանակը ըստ կարիքների:
G. Փոխանցման գործընթացում լարման փոփոխությունը պետք է դիտարկվի ցանկացած պահի, և ցանկացած աննորմալություն պետք է ժամանակին կարգավորվի:
Հրապարակման ժամանակը` 07-07-2022
