Hoe scheidingslijm te gebruiken?
Western-blot-membraanoverdracht
Onder invloed van stroom wordt het eiwit overgebracht van de gel naar de vaste drager (membraan).
Membraanselectie: de veelgebruikte materialen in vaste fase bij het bedrukken zijn onder meer NC-membraan, DBM, DDT, nylonmembraan, PVDF, enz. We kiezen voor PVDF (polyvinylideenfluoride), dat een betere eiwitadsorptie, fysieke sterkte en betere chemische compatibiliteit heeft.Er zijn twee specificaties: immobilon-p (0,45um) en immobilon PSQ (0,2um voor MW < 20kDa).
Een halfdroge methode
Dat wil zeggen, de gel-tussenlaagcombinatie wordt tussen het filterpapier met de overdrachtsbuffer geplaatst en de stroom wordt door de buffer geleid die op het filterpapier is geadsorbeerd om het overdrachtseffect te bereiken.Omdat de stroom rechtstreeks op de filmlijm inwerkt, zijn de overdrachtsomstandigheden relatief zwaar, maar de overdrachtstijd is kort en het rendement is hoog.
(1) selectie van experimentele omstandigheden
De stroom is 1ma-2ma / cm2, en we gebruiken meestal 100mA / membraan.De overdrachtstijd kan worden geselecteerd op basis van de grootte van het doeleiwitmolecuul en de gelconcentratie, en kan op de juiste manier worden aangepast aan de werkelijke situatie.
Target eiwit moleculaire grootte (kDa), gelconcentratie en overdrachtstijd
80 --- 140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1.5
15-40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) experimentele werking
(1) Bereiding van filtreerpapier en membraan (bereiding moet 20 minuten vóór elektroforese worden gestart).
A. Controleer of er voldoende overdrachtsbuffers zijn, die niet meteen worden voorbereid.
B. Controleer of er filtreerpapier en membraan van de juiste maat aanwezig is.
C. Dompel het membraan ongeveer 1-2 minuten onder in methanol.En vervolgens overgebracht naar de overdrachtsbuffer.
D. Drenk respectievelijk het juiste klevende filtreerpapier en het membraanfiltreerpapier in de transferbuffer.
Hoe lang moet het PDVF-membraan in methanol weken wanneer het de overdrachtsbuffer binnengaat?
PVDF is hydrofoob en het is moeilijk om in de overdrachtsbuffer te weken.Na methanolbehandeling is het gemakkelijker om te weken.De voorbehandeling van PVDF is om het te weken en te activeren met methanol, en het vervolgens twee keer te wassen met gedestilleerd water na grondig te hebben doorweekt.Het doel van het gebruik van methanolbellen is om de positief geladen groepen op het PVDF-membraan te activeren en de binding met negatief geladen eiwitten te vergemakkelijken.
Mensen gebruiken het meestal 5-20 minuten.Het kan tegelijkertijd met het nemen van de lijm worden geweekt en naar schatting duurt dit ongeveer 5 minuten.Het effect is niet slecht.In het verleden hebben sommige webvrienden gepost dat de verwerkingstijd er niet zoveel toe deed, maar dat het belangrijkste de kwaliteit van de film was.Dat is waar.Zolang het membraan volledig doorweekt is, zou het in orde moeten zijn.
De PVDF-specificatie van Hybond luidt als volgt: "bevochtig het membraan vooraf in 100% metanol (10 seconden)".Ik heb begrepen dat het oké is om minstens 10 seconden te weken.In feite is het prima om 10 seconden of 10 minuten te weken.
(2) Overdracht
A. Leg het onderste filterpapier op het elektrische overdrachtsinstrument.Over het algemeen worden drie lagen gebruikt.
B. Leg het membraan op het filtreerpapier tegen het membraan, let erop dat er geen luchtbellen tussen het membraan en het filtreerpapier komen en giet wat transferbuffer op het membraan om het membraan nat te houden.
C. Verwijder de lijm, verwijder de stapelgel en breng deze voorzichtig op de film aan.
D. Knip de linkerbovenhoek van de film af en markeer de lijmpositie op de film met een potlood.
E. Bedek een stuk filtreerpapier tegen de lijm op de lijm.Giet wat transferbuffer en leg twee stukken filtreerpapier.
F. Installeer het elektrische overdrachtsinstrument en selecteer de vereiste stroom en tijd volgens de behoeften.
G. Tijdens het overdrachtsproces moet de spanningsverandering op elk moment worden waargenomen en moet elke afwijking tijdig worden aangepast.
Posttijd: 07-07-2022
