Ayırma yapıştırıcısı nasıl kullanılır?- Bölüm 1

Ayırma yapıştırıcısı nasıl kullanılır?

Western blot membran transferi

Akımın etkisi altında, protein jelden katı taşıyıcıya (membrana) aktarılır.

Membran seçimi: Baskıda yaygın olarak kullanılan katı fazlı malzemeler arasında NC membran, DBM, DDT, naylon membran, PVDF, vb. bulunur. Daha iyi protein adsorpsiyonu, fiziksel mukavemet ve daha iyi kimyasal uyumluluğa sahip olan PVDF'yi (poliviniliden florür) seçiyoruz.İki spesifikasyon vardır: immobilon-p (0,45um) ve immobilon PSQ (MW < 20kDa için 0,2um).

Yarı kuru bir yöntem

Yani, jel ara katman kombinasyonu, filtre kağıdı ile transfer tamponu arasına yerleştirilir ve transfer etkisini elde etmek için akım, filtre kağıdına adsorbe edilen tampon yoluyla iletilir.Akım doğrudan film yapıştırıcısına etki ettiğinden, transfer koşulları nispeten serttir, ancak transfer süresi kısadır ve verimlilik yüksektir.

(1) deneysel koşulların seçimi

Akım 1ma-2ma/cm2'dir ve genellikle 100mA/membran kullanırız.Transfer süresi, hedef protein molekülünün boyutuna ve jel konsantrasyonuna göre seçilebilir ve fiili duruma göre uygun şekilde ayarlanabilir.

Hedef protein moleküler boyutu (kDa), jel konsantrasyonu ve transfer süresi

80---140 %8 1,5-2,0

25---80 %10 1,5

15—40 %12 0,75

<20 %15 0,5

(2) deneysel operasyon

(1) Filtre kağıdı ve membranın hazırlanması (hazırlığa elektroforezden 20 dakika önce başlanmalıdır).

A. Hemen hazırlanmayan yeterli transfer arabelleği olup olmadığını kontrol edin.

B. Uygun boyutta filtre kağıdı ve membran olup olmadığını kontrol edin.

C. Membranı yaklaşık 1-2 dakika metanole daldırın.Ve sonra transfer arabelleğine aktarılır.

D. Uygun yapışkan filtre kağıdını ve membran filtre kağıdını sırasıyla transfer tamponuna batırın.

Transfer tamponuna girerken PDVF membranı ne kadar süreyle metanol içinde kalmalıdır?

PVDF hidrofobiktir ve transfer tamponuna batırılması zordur.Metanol işleminden sonra ıslatmak daha kolaydır.PVDF'nin ön işlemi, onu metanol ile ıslatmak ve aktive etmek ve ardından iyice ıslattıktan sonra iki kez damıtılmış suyla yıkamaktır.Metanol kabarcıklarının kullanılmasının amacı, PVDF zarı üzerindeki pozitif yüklü grupları aktive etmek ve negatif yüklü proteinlerle bağlanmasını kolaylaştırmaktır.

İnsanlar genellikle 5-20 dakika kullanırlar.Yapıştırıcıyı alırken aynı anda ıslatılabilir ve yaklaşık 5 dakika süreceği tahmin edilmektedir.Etkisi kötü değil.Geçmişte, bazı web arkadaşları, işlem süresinin çok önemli olmadığını, ancak anahtarın filmin kalitesi olduğunu bildirdi.Bu doğru.Membran tamamen ıslandığı sürece sorun yok.

Hybond'un PVDF spesifikasyonu şu şekildedir: "membranı %100 metanol içinde önceden ıslatın (10 saniye)".Anladığım kadarıyla en az 10 saniye suda bekletmek sorun değil.Aslında, 10 saniye veya 10 dakika suda bekletmek sorun değil.

(2) Transfer

A. Alt filtre kağıdını elektrikli transfer aletinin üzerine yerleştirin.Genellikle üç katman kullanılır.

B. Membranı filtre kağıdının üzerine membrana gelecek şekilde yerleştirin, membran ile filtre kağıdı arasında hava kabarcığı olmamasına dikkat edin ve membranın ıslak kalması için membranın üzerine bir miktar transfer tamponu dökün.

C. Yapıştırıcıyı soyun, yığın jelini çıkarın ve dikkatli bir şekilde filmin üzerine taşıyın.

D. Filmin sol üst köşesini kesin ve film üzerindeki tutkal konumunu bir kalemle işaretleyin.

E. Tutkalın üzerine bir parça filtre kağıdı yapıştırın.Bir miktar transfer tamponu dökün ve iki adet filtre kağıdı yerleştirin.

F. Elektrik transfer aletini kurun ve ihtiyaca göre gerekli akımı ve zamanı seçin.

G. Transfer işlemi sırasında, voltaj değişimi herhangi bir zamanda gözlemlenecek ve herhangi bir anormallik zamanında ayarlanacaktır.