วิธีการใช้กาวแยก?- ส่วนที่ 1

วิธีการใช้กาวแยก?

การถ่ายโอนเมมเบรนแบบ Western blot

ภายใต้การกระทำของกระแส โปรตีนจะถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังตัวพาที่เป็นของแข็ง (เมมเบรน)

การเลือกเมมเบรน: วัสดุเฟสของแข็งที่ใช้กันทั่วไปในการพิมพ์ ได้แก่ เมมเบรน NC, DBM, DDT, เมมเบรนไนลอน, PVDF เป็นต้น เราเลือก PVDF (โพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์) ซึ่งมีการดูดซับโปรตีนที่ดีกว่า ความแข็งแรงทางกายภาพ และความเข้ากันได้ทางเคมีที่ดีกว่ามีสองข้อกำหนด: immobilon-p (0.45um) และ immobilon PSQ (0.2um สำหรับ MW < 20kDa)

วิธีกึ่งแห้ง

นั่นคือ การผสมเจลระหว่างชั้นถูกวางไว้ระหว่างกระดาษกรองกับบัฟเฟอร์การถ่ายโอน และกระแสไฟฟ้าถูกส่งผ่านบัฟเฟอร์ที่ดูดซับบนกระดาษกรองเพื่อให้ได้เอฟเฟกต์การถ่ายโอนเนื่องจากกระแสไฟฟ้าทำหน้าที่โดยตรงกับกาวฟิล์ม เงื่อนไขการถ่ายโอนจึงค่อนข้างรุนแรง แต่เวลาในการถ่ายโอนสั้นและประสิทธิภาพสูง

(1) การเลือกเงื่อนไขการทดลอง

ปัจจุบันคือ 1ma-2ma / cm2 และเรามักจะใช้ 100mA / เมมเบรนสามารถเลือกเวลาในการถ่ายโอนได้ตามขนาดของโมเลกุลโปรตีนเป้าหมายและความเข้มข้นของเจล และปรับเปลี่ยนได้อย่างเหมาะสมตามสถานการณ์จริง

ขนาดโมเลกุลของโปรตีนเป้าหมาย (kDa) ความเข้มข้นของเจล และเวลาในการถ่ายโอน

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) การดำเนินการทดลอง

(1) การเตรียมกระดาษกรองและเมมเบรน (การเตรียมจะต้องเริ่ม 20 นาทีก่อนอิเล็กโตรโฟรีซิส)

A. ตรวจสอบว่ามีบัฟเฟอร์ถ่ายโอนเพียงพอหรือไม่ ซึ่งไม่ได้เตรียมไว้ทันที

ข. ตรวจสอบว่ามีกระดาษกรองและเมมเบรนที่มีขนาดเหมาะสมหรือไม่

C. แช่เมมเบรนในเมทานอลประมาณ 1-2 นาทีจากนั้นโอนไปยังบัฟเฟอร์การโอน

D. แช่กระดาษกรองกาวที่เหมาะสมและกระดาษกรองเมมเบรนลงในบัฟเฟอร์การถ่ายโอนตามลำดับ

เมมเบรน PDVF ควรแช่ในเมทานอลนานเท่าใดเมื่อเข้าสู่บัฟเฟอร์การถ่ายโอน

PVDF ไม่ชอบน้ำและยากต่อการแช่ในบัฟเฟอร์การถ่ายโอนหลังจากการบำบัดด้วยเมทานอลแล้ว การแช่จะง่ายขึ้นการปรับสภาพของ PVDF คือการแช่และเปิดใช้งานด้วยเมทานอล จากนั้นล้างมันสองครั้งด้วยน้ำกลั่นหลังจากแช่จนทั่วแล้วจุดประสงค์ของการใช้ฟองเมทานอลคือเพื่อกระตุ้นกลุ่มที่มีประจุบวกบนเมมเบรน PVDF และทำให้จับกับโปรตีนที่มีประจุลบได้ง่ายขึ้น

คนมักจะใช้เวลา 5-20 นาทีสามารถแช่ได้พร้อมกับการทากาวและคาดว่าจะใช้เวลาประมาณ 5 นาทีเอฟเฟกต์ไม่เลวเมื่อก่อนเพื่อนในเว็บบางคนโพสต์ว่าเวลาในการประมวลผลไม่สำคัญเท่าไหร่ แต่สิ่งสำคัญคือคุณภาพของฟิล์มนั่นเป็นเรื่องจริงตราบใดที่เมมเบรนยังเปียกอยู่ ก็น่าจะใช้ได้

ข้อมูลจำเพาะ PVDF ของ Hybond อ่านได้ดังนี้: "ทำให้เมมเบรนเปียกก่อนในเมทานอล 100% (10 วินาที)"ความเข้าใจของฉันคือการแช่อย่างน้อย 10 วินาทีเป็นเรื่องปกติอันที่จริง การแช่ตัวเป็นเวลา 10 วินาทีหรือ 10 นาทีก็เป็นเรื่องปกติ

(2) การโอน

A. วางกระดาษกรองด้านล่างบนเครื่องมือถ่ายโอนไฟฟ้าโดยทั่วไปจะใช้สามชั้น

B. วางเมมเบรนบนกระดาษกรองกับเมมเบรน ระวังอย่าให้มีฟองอากาศระหว่างเมมเบรนกับกระดาษกรอง และเทบัฟเฟอร์การถ่ายโอนบางส่วนลงบนเมมเบรนเพื่อให้เมมเบรนเปียก

C. ลอกกาวออก ดึงสแต็กเจลออก แล้วค่อยๆ เลื่อนไปบนฟิล์ม

D. ตัดมุมซ้ายบนของฟิล์มออกแล้วทำเครื่องหมายตำแหน่งกาวบนฟิล์มด้วยดินสอ

E. คลุมกระดาษกรองกับกาวบนกาวเทบัฟเฟอร์การถ่ายโอนและวางกระดาษกรองสองแผ่น

F. ติดตั้งเครื่องมือถ่ายโอนไฟฟ้าและเลือกกระแสและเวลาที่ต้องการตามความต้องการ

G. ในระหว่างกระบวนการถ่ายโอน จะต้องสังเกตการเปลี่ยนแปลงของแรงดันไฟฟ้าได้ตลอดเวลา และความผิดปกติใด ๆ จะต้องได้รับการปรับตามเวลา