Kuidas kasutada eraldusliimi?- 1. osa

Kuidas kasutada eraldusliimi?

Western blot membraani ülekanne

Voolu toimel kantakse valk geelist tahkele kandjale (membraanile).

Membraani valik: trükkimisel tavaliselt kasutatavad tahkefaasilised materjalid on NC-membraan, DBM, DDT, nailonmembraan, PVDF jne. Valime PVDF-i (polüvinülideenfluoriid), millel on parem valkude adsorptsioon, füüsiline tugevus ja parem keemiline ühilduvus.Spetsifikatsioone on kaks: immobilon-p (0,45 um) ja immobilon PSQ (0,2 um MW < 20 kDa korral).

Poolkuiv meetod

See tähendab, et geeli vahekihtide kombinatsioon asetatakse ülekandepuhvriga filterpaberi vahele ja vool juhitakse läbi filterpaberile adsorbeeritud puhvri, et saavutada ülekandeefekt.Kuna vool mõjutab otse kile liimi, on ülekandetingimused suhteliselt karmid, kuid ülekandeaeg on lühike ja efektiivsus kõrge.

(1) katsetingimuste valik

Vool on 1ma-2ma / cm2 ja me kasutame tavaliselt 100mA / membraan.Ülekandeaega saab valida vastavalt sihtvalgu molekuli suurusele ja geeli kontsentratsioonile ning seda saab vastavalt tegelikule olukorrale vastavalt reguleerida.

Sihtvalgu molekuli suurus (kDa), geeli kontsentratsioon ja ülekandeaeg

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) eksperimentaalne operatsioon

(1) Filterpaberi ja membraani ettevalmistamine (ettevalmistamist alustatakse 20 minutit enne elektroforeesi).

V. Kontrollige, kas seal on piisavalt ülekandepuhvreid, mida ei valmistata kohe ette.

B. Kontrollige, kas filterpaber ja membraan on õige suurusega.

C. Kastke membraan umbes 1-2 minutiks metanooli.Ja siis kanti üle ülekandepuhvrisse.

D. Leotage sobiv kleepuv filterpaber ja membraanfilterpaber vastavalt ülekandepuhvrisse.

Kui kaua peaks PDVF membraan ülekandepuhvri sisenemisel metanoolis leotama?

PVDF on hüdrofoobne ja seda on raske ülekandepuhvris leotada.Pärast metanooliga töötlemist on seda lihtsam leotada.PVDF-i eeltöötluseks on selle leotamine ja aktiveerimine metanooliga ning seejärel pärast põhjalikku leotamist kaks korda destilleeritud veega pesemine.Metanoolimullide kasutamise eesmärk on aktiveerida PVDF membraanil olevad positiivselt laetud rühmad ja hõlbustada seondumist negatiivselt laetud valkudega.

Inimesed kasutavad seda tavaliselt 5-20 minutit.Seda saab leotada samaaegselt liimi võtmisega ja hinnanguliselt kulub selleks umbes 5 minutit.Mõju pole halb.Varem postitasid mõned veebisõbrad, et töötlemisajal pole suurt tähtsust, kuid peamine oli filmi kvaliteet.See on tõsi.Kuni membraan on täielikult läbi imbunud, peaks see olema korras.

Hybondi PVDF-i spetsifikatsioon on järgmine: "eelselt niisutage membraan 100% metanoolis (10 sekundit)".Ma saan aru, et vähemalt 10 sekundit on okei leotada.Tegelikult on okei leotada 10 sekundit või 10 minutit.

(2) Ülekandmine

A. Asetage alumine filterpaber elektrilisele ülekandeinstrumendile.Tavaliselt kasutatakse kolme kihti.

B. Asetage membraan filterpaberile vastu membraani, jälgige, et membraani ja filterpaberi vahele ei jääks mullid, ning valage membraanile veidi ülekandepuhvrit, et hoida membraan märjana.

C. Eemaldage liim, eemaldage virnageel ja liigutage see ettevaatlikult kilele.

D. Lõika kilelt ülemine vasak nurk ära ja märgi pliiatsiga kilele liimiasend.

E. Katke filterpaberi tükk liimi vastu.Valage veidi ülekandepuhvrit ja asetage kaks tükki filterpaberit.

F. Paigaldage elektriline ülekandeinstrument ja valige vastavalt vajadustele vajalik vool ja aeg.

G. Ülekandeprotsessi ajal tuleb pinge muutust igal ajal jälgida ja kõik kõrvalekalded tuleb õigeaegselt korrigeerida.