כיצד להשתמש בדבק הפרדה?
העברת קרום כתם מערבי
בפעולת הזרם, החלבון מועבר מהג'ל אל הנשא המוצק (הממברנה).
בחירת ממברנה: החומרים הנפוצים בשימוש בשלב מוצק בהטבעה כוללים ממברנת NC, DBM, DDT, ממברנת ניילון, PVDF וכו'. אנו בוחרים ב-PVDF (פוליווינילידן פלואוריד), בעל ספיחת חלבון טובה יותר, חוזק פיזי ותאימות כימית טובה יותר.ישנם שני מפרטים: immobilon-p (0.45um) ו-immobilon PSQ (0.2um עבור MW < 20kDa).
שיטה חצי יבשה
כלומר, שילוב השכבות הג'ל מונח בין נייר הסינון עם חיץ ההעברה, והזרם מועבר דרך המאגר שנספג על נייר הסינון כדי להשיג את אפקט ההעברה.מכיוון שהזרם פועל ישירות על דבק הסרט, תנאי ההעברה קשים יחסית, אך זמן ההעברה קצר והיעילות גבוהה.
(1) בחירת תנאי ניסוי
הזרם הוא 1ma-2ma / cm2, ובדרך כלל אנו משתמשים ב-100mA / ממברנה.ניתן לבחור את זמן ההעברה בהתאם לגודל מולקולת חלבון המטרה וריכוז הג'ל, וניתן להתאים אותו בהתאם למצב בפועל.
גודל חלבון מולקולרי יעד (kDa), ריכוז ג'ל וזמן העברה
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10% 1.5
15—40 12% 0.75
<20 15% 0.5
(2) פעולה נסיונית
(1) הכנת נייר סינון וממברנה (ההכנה תתחיל 20 דקות לפני האלקטרופורזה).
א. יש לבדוק האם יש מספיק מאגרי העברה, שאינם מוכנים מיד.
ב.בדוק אם יש נייר סינון וקרום בגודל מתאים.
ג. לטבול את הממברנה במתנול למשך כ-1-2 דקות.ואז הועבר למאגר ההעברה.
ד. השרו את נייר הסינון הדביק המתאים ונייר הסינון הממברנה במאגר ההעברה בהתאמה.
כמה זמן צריך להשרות את ממברנת ה-PDVF במתנול כשנכנסים למאגר ההעברה?
PVDF הוא הידרופובי, וקשה להשרות אותו במאגר ההעברה.לאחר טיפול במתנול, קל יותר להשרות.הטיפול המקדים של PVDF הוא להשרות ולהפעיל אותו עם מתנול, ולאחר מכן לשטוף אותו פעמיים עם מים מזוקקים לאחר השרייה יסודית.מטרת השימוש בבועות מתנול היא להפעיל את הקבוצות הטעונות באופן חיובי על ממברנת ה-PVDF ולהקל על הקישור עם חלבונים בעלי מטען שלילי.
אנשים בדרך כלל משתמשים בו במשך 5-20 דקות.ניתן להשרות אותו במקביל לנטילת הדבק, וההערכה היא שזה ייקח כ-5 דקות.ההשפעה לא רעה.בעבר, כמה מחברי אינטרנט פרסמו שזמן העיבוד לא משנה הרבה, אבל המפתח היה איכות הסרט.זה נכון.כל עוד הממברנה ספוג לחלוטין, זה אמור להיות תקין.
מפרט ה-PVDF של Hybond כתוב כך: "הרטב מראש את הממברנה ב-100% מתנול (10 שניות)".הבנתי שזה בסדר להשרות לפחות 10 שניות.למעשה, זה בסדר להשרות למשך 10 שניות או 10 דקות.
(2) העברה
א הנח את נייר הסינון התחתון על מכשיר ההעברה החשמלי.בדרך כלל משתמשים בשלוש שכבות.
ב. הניחו את הממברנה על נייר הסינון כנגד הממברנה, שימו לב שלא יהיו בועות בין הממברנה לנייר הסינון, ושופכים מעט חוצץ העברה על הממברנה כדי לשמור על הממברנה רטובה.
ג. מקלפים את הדבק, מסירים את ג'ל הערימה ומעבירים אותו בזהירות על הסרט.
ד חתוך את הפינה השמאלית העליונה של הסרט וסמן בעיפרון את מיקום הדבק על הסרט.
ה. מכסים פיסת נייר סינון כנגד הדבק שעל הדבק.יוצקים קצת חיץ העברה והניח שתי חתיכות של נייר סינון.
ו.התקן את מכשיר ההעברה החשמלי ובחר את הזרם והזמן הנדרשים בהתאם לצרכים.
ז. במהלך תהליך ההעברה, יש להבחין בשינוי המתח בכל עת, וכל חריגה תותאם בזמן.
זמן פרסום: 07-07-2022
