වෙන් කිරීමේ මැලියම් භාවිතා කරන්නේ කෙසේද?- 1 කොටස

වෙන් කිරීමේ මැලියම් භාවිතා කරන්නේ කෙසේද?

Western blot membrane මාරු කිරීම

ධාරාවෙහි ක්රියාකාරිත්වය යටතේ, ප්රෝටීන් ජෙල් සිට ඝන වාහකය (පටල) වෙත මාරු කරනු ලැබේ.

පටල තෝරා ගැනීම: මුද්‍රණය කිරීමේදී බහුලව භාවිතා වන ඝන-අදියර ද්‍රව්‍ය අතරට NC පටල, DBM, DDT, නයිලෝන් පටල, PVDF, ආදිය ඇතුළත් වේ. අපි PVDF (polyvinylidene fluoride) තෝරා ගනිමු, එය වඩා හොඳ ප්‍රෝටීන් අවශෝෂණය, භෞතික ශක්තිය සහ වඩා හොඳ රසායනික අනුකූලතාවයක් ඇත.පිරිවිතර දෙකක් ඇත: immobilon-p (0.45um) සහ immobilon PSQ (MW <20kDa සඳහා 0.2um).

අර්ධ වියළි ක්රමයකි

එනම්, ජෙල් අන්තර් ස්ථර සංයෝජනය මාරු කිරීමේ බෆරය සමඟ පෙරහන් කඩදාසි අතර තබා ඇති අතර, මාරු කිරීමේ බලපෑම ලබා ගැනීම සඳහා ධාරාව පෙරහන් කඩදාසි මත අවශෝෂණය කරන ලද බෆරය හරහා සිදු කෙරේ.ධාරාව චිත්රපට මැලියම් මත සෘජුව ක්රියා කරන නිසා, මාරු කිරීමේ කොන්දේසි සාපේක්ෂව දරුණු වේ, නමුත් මාරු කිරීමේ කාලය කෙටි වන අතර කාර්යක්ෂමතාව ඉහළ ය.

(1) පර්යේෂණාත්මක කොන්දේසි තෝරාගැනීම

ධාරාව 1ma-2ma / cm2 වන අතර, අපි සාමාන්‍යයෙන් 100mA / membrane භාවිතා කරමු.ඉලක්කගත ප්‍රෝටීන් අණුවේ ප්‍රමාණය සහ ජෙල් සාන්ද්‍රණය අනුව හුවමාරු කාලය තෝරා ගත හැකි අතර සත්‍ය තත්ත්වය අනුව සුදුසු පරිදි සකස් කළ හැක.

ඉලක්කගත ප්‍රෝටීන් අණුක ප්‍රමාණය (kDa), ජෙල් සාන්ද්‍රණය සහ මාරු කාලය

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15-40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) පර්යේෂණාත්මක මෙහෙයුම

(1) පෙරහන කඩදාසි සහ පටල සකස් කිරීම (ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස්ට මිනිත්තු 20 කට පෙර සකස් කිරීම ආරම්භ කළ යුතුය).

A. ප්‍රමාණවත් තරම් හුවමාරු බෆර තිබේදැයි පරීක්ෂා කරන්න, ඒවා වහාම සකස් කර නැත.

B. පෙරහන කඩදාසි සහ නියමිත ප්‍රමාණයේ පටල තිබේදැයි පරීක්ෂා කරන්න.

C. පටලය විනාඩි 1-2ක් පමණ මෙතනෝල් වල ගිල්වන්න.ඉන්පසු මාරු බෆරයට මාරු කර ඇත.

D. පිළිවෙළින් මාරු බෆරය තුළට සුදුසු ඇලවුම් පෙරහන කඩදාසි සහ පටල පෙරහන කඩදාසි පොඟවා ගන්න.

හුවමාරු බෆරයට ඇතුළු වන විට PDVF පටලය මෙතනෝල්වල කොපමණ කාලයක් පොඟවා ගත යුතුද?

PVDF ජලභීතික වන අතර, එය මාරු බෆරයේ පොඟවා ගැනීම අපහසු වේ.මෙතනෝල් ප්රතිකාර කිරීමෙන් පසුව, එය පොඟවා ගැනීම පහසුය.PVDF හි පූර්ව ප්‍රතිකාරය වන්නේ මෙතනෝල් සමඟ පොඟවා සක්‍රීය කිරීම, පසුව හොඳින් පොඟවා ආස්රැත ජලයෙන් දෙවරක් සේදීමයි.මෙතනෝල් බුබුලු භාවිතා කිරීමේ අරමුණ වන්නේ PVDF පටලය මත ධන ආරෝපිත කන්ඩායම් සක්රිය කිරීම සහ සෘණ ආරෝපිත ප්රෝටීන සමඟ බැඳීම පහසු කිරීමයි.

මිනිසුන් සාමාන්යයෙන් එය විනාඩි 5-20 ක් භාවිතා කරයි.මැලියම් ගැනීමේදී එකවරම පොඟවා ගත හැකි අතර, එය විනාඩි 5 ක් පමණ ගතවනු ඇතැයි ගණන් බලා ඇත.බලපෑම නරක නැත.පසුගිය කාලයේ සමහර වෙබ් මිතුරන් විසින් ප්‍රොසෙසින් කරන කාලය එතරම් වැදගත් නොවූවත් ප්‍රධානම කරුණ වූයේ චිත්‍රපටයේ ගුණාත්මක බව බව පළ කර ඇත.එය ඇත්ත.පටලය සම්පූර්ණයෙන්ම පොඟවා ඇති තාක් කල්, එය හරි විය යුතුය.

Hybond හි PVDF පිරිවිතර පහත පරිදි කියවේ: "පටලය 100% මෙටනෝල් (තත්පර 10) කින් පෙර තෙත් කරන්න".මගේ වැටහීම නම් අඩුම තරමින් තත්පර 10 ක් වත් පොඟවා ගැනීම සුදුසු බවයි.ඇත්ත වශයෙන්ම, තත්පර 10 ක් හෝ විනාඩි 10 ක් පොඟවා ගැනීම සුදුසුය.

(2) මාරු කිරීම

A. විද්යුත් හුවමාරු උපකරණය මත පහළ පෙරහන කඩදාසි තබන්න.සාමාන්යයෙන් ස්ථර තුනක් භාවිතා වේ.

B. පටලයට එරෙහිව පටලය පෙරහන කඩදාසිය මත තබන්න, පටලය සහ පෙරහන් කඩදාසිය අතර බුබුලු ඇති නොවීමට අවධානය යොමු කරන්න, සහ පටලය තෙත් කර තබා ගැනීමට පටලය මතට මාරු බෆරයක් වත් කරන්න.

C. මැලියම් ඉවත් කරන්න, ස්ටැක් ජෙල් ඉවත් කර ප්රවේශමෙන් චිත්රපටය මතට ගෙන යන්න.

D. චිත්රපටයේ ඉහළ වම් කෙළවරේ කපා ඉවත් කර පැන්සලකින් චිත්රපටයේ මැලියම් ස්ථානය සලකුණු කරන්න.

E. මැලියම් මත ඇති මැලියම් වලට එරෙහිව පෙරහන කඩදාසි කැබැල්ලක් ආවරණය කරන්න.මාරු බෆරයක් වත් කර පෙරහන් කඩදාසි කැබලි දෙකක් දමන්න.

F. විද්‍යුත් හුවමාරු උපකරණය ස්ථාපනය කර අවශ්‍යතා අනුව අවශ්‍ය ධාරාව සහ කාලය තෝරන්න.

G. මාරු කිරීමේ ක්රියාවලියේදී, වෝල්ටීයතා වෙනස්වීම ඕනෑම අවස්ථාවක නිරීක්ෂණය කළ යුතු අතර, කිසියම් අසාමාන්යතාවයක් නියමිත වේලාවට සකස් කළ යුතුය.