Kā lietot atdalīšanas līmi?– 1. daļa

Kā lietot atdalīšanas līmi?

Western blot membrānas pārnešana

Strāvas iedarbībā proteīns tiek pārnests no želejas uz cieto nesēju (membrānu).

Membrānas izvēle: drukāšanā parasti izmantotie cietās fāzes materiāli ir NC membrāna, DBM, DDT, neilona membrāna, PVDF utt. Mēs izvēlamies PVDF (polivinilidēna fluorīdu), kam ir labāka olbaltumvielu adsorbcija, fiziskā izturība un labāka ķīmiskā savietojamība.Ir divas specifikācijas: immobilon-p (0,45 um) un immobilon PSQ (0, 2 um, ja MW < 20 kDa).

Daļēji sausa metode

Tas ir, gēla starpslāņu kombinācija tiek novietota starp filtrpapīru ar pārneses buferi, un strāva tiek vadīta caur buferi, kas adsorbēts uz filtrpapīra, lai panāktu pārneses efektu.Tā kā strāva iedarbojas tieši uz plēves līmi, pārvietošanas apstākļi ir salīdzinoši skarbi, bet pārsūtīšanas laiks ir īss un efektivitāte ir augsta.

(1) eksperimentālo apstākļu izvēle

Strāva ir 1ma-2ma / cm2, un mēs parasti izmantojam 100mA / membrāna.Pārneses laiku var izvēlēties atbilstoši mērķa proteīna molekulas izmēram un gēla koncentrācijai, un to var atbilstoši pielāgot atbilstoši faktiskajai situācijai.

Mērķa proteīna molekulārais izmērs (kDa), gēla koncentrācija un pārneses laiks

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0.5

(2) eksperimentālā darbība

(1) Filtrpapīra un membrānas sagatavošana (sagatavošana jāuzsāk 20 minūtes pirms elektroforēzes).

A. Pārbaudiet, vai ir pietiekami daudz pārsūtīšanas buferu, kas netiek sagatavoti nekavējoties.

B. Pārbaudiet, vai ir piemērota izmēra filtrpapīrs un membrāna.

C. Iegremdējiet membrānu metanolā uz apmēram 1-2 minūtēm.Un pēc tam pārsūtīts uz pārsūtīšanas buferi.

D. Iemērciet attiecīgo lipīgo filtrpapīru un membrānas filtrpapīru attiecīgi pārneses buferšķīdumā.

Cik ilgi PDVF membrānai vajadzētu iesūkties metanolā, ievadot pārneses buferšķīdumu?

PVDF ir hidrofobs, un to ir grūti iesūkties pārneses buferšķīdumā.Pēc apstrādes ar metanolu to ir vieglāk mērcēt.PVDF pirmapstrāde ir to mērcēt un aktivizēt ar metanolu, un pēc tam pēc rūpīgas mērcēšanas divreiz mazgāt ar destilētu ūdeni.Metanola burbuļu izmantošanas mērķis ir aktivizēt pozitīvi lādētās grupas uz PVDF membrānas un atvieglot saistīšanos ar negatīvi lādētām olbaltumvielām.

Cilvēki parasti to lieto 5-20 minūtes.To var mērcēt vienlaikus ar līmes ņemšanu, un tiek lēsts, ka tas prasīs apmēram 5 minūtes.Efekts nav slikts.Agrāk daži tīmekļa draugi rakstīja, ka apstrādes laikam nav lielas nozīmes, taču galvenais bija filmas kvalitāte.Tā ir taisnība.Kamēr membrāna ir pilnībā izmirkusi, tai jābūt kārtībā.

Hybond's PVDF specifikācija skan šādi: "iepriekš samitriniet membrānu 100% metanolā (10 sekundes)".Es saprotu, ka ir pareizi mērcēt vismaz 10 sekundes.Patiesībā ir pareizi mērcēt 10 sekundes vai 10 minūtes.

(2) Nodošana

A. Uzlieciet apakšējo filtrpapīru uz elektriskā pārsūtīšanas instrumenta.Parasti tiek izmantoti trīs slāņi.

B. Uzlieciet membrānu uz filtrpapīra pret membrānu, pievērsiet uzmanību tam, lai starp membrānu un filtrpapīru nebūtu burbuļu, un uzlejiet membrānai nedaudz pārnešanas bufera, lai membrāna būtu mitra.

C. Noņemiet līmi, noņemiet kaudzes želeju un uzmanīgi pārvietojiet to uz plēves.

D. Nogrieziet plēves augšējo kreiso stūri un ar zīmuli atzīmējiet līmes pozīciju uz plēves.

E. Nosedziet filtrpapīra gabalu pret līmi uz līmes.Ielejiet nedaudz pārnešanas buferšķīduma un uzlieciet divus filtrpapīra gabalus.

F. Uzstādiet elektrisko pārvades instrumentu un izvēlieties nepieciešamo strāvu un laiku atbilstoši vajadzībām.

G. Pārsūtīšanas procesa laikā sprieguma izmaiņas jānovēro jebkurā laikā, un visas novirzes savlaicīgi jānoregulē.