Wéi benotzen ech Trennkleim?
Western blot Membran Transfert
Ënnert der Handlung vum Stroum gëtt de Protein vum Gel op de festen Träger (Membran) transferéiert.
Membran Auswiel: déi allgemeng benotzt zolidd-Phase Materialien an imprinting och NC Membran, DBM, DDT, Nylon Membran, PVDF, etc.. Mir wielen PVDF (polyvinylidene fluoride), déi besser Protein adsorption, kierperlech Kraaft a besser chemesch Onbedenklechkeet.Et ginn zwou Spezifikatioune: immobilon-p (0.45um) an immobilon PSQ (0.2um fir MW <20kDa).
Eng semi dréchen Method
Dat ass, d'Gel Interlayer Kombinatioun gëtt tëscht dem Filterpabeier mam Transferbuffer plazéiert, an de Stroum gëtt duerch de Puffer gefouert, deen op de Filterpabeier adsorbéiert ass, fir den Transfereffekt z'erreechen.Well de Stroum direkt op de Filmklebstoff handelt, sinn d'Transferbedingunge relativ haart, awer d'Transferzäit ass kuerz an d'Effizienz ass héich.
(1) Auswiel vun experimentell Konditiounen
De Stroum ass 1ma-2ma / cm2, a mir benotzen normalerweis 100mA / Membran.D'Transferzäit kann no der Gréisst vum Zilproteinmolekül an der Gel Konzentratioun ausgewielt ginn, a ka passend no der aktueller Situatioun ugepasst ginn.
Zilprotein Molekulare Gréisst (kDa), Gel Konzentratioun an Transfert Zäit
80---140 8% 1,5-2,0
25---80 10% 1,5
15-40 12% 0,75
<20 15% 0,5
(2) experimentell Operatioun
(1) Virbereedung vu Filterpabeier a Membran (Virbereedung soll 20 Minutte virun der Elektrophorese gestart ginn).
A. Kuckt ob et genuch Transferbuffer gëtt, déi net direkt virbereet ginn.
B. Kuckt ob et Filterpabeier a Membran vun der richteger Gréisst gëtt.
C. Taucht d'Membran an Methanol fir ongeféier 1-2 Minutten.An dann op den Transferbuffer transferéiert.
D. Soak déi entspriechend Klebstofffilterpabeier a Membranfilterpabeier an den Transferbuffer respektiv.
Wéi laang soll d'PDVF Membran am Methanol drénken wann Dir an den Transferbuffer erakënnt?
PVDF ass hydrophobesch, an et ass schwéier am Transferbuffer ze drénken.No der Methanolbehandlung ass et méi einfach ze drénken.D'Virbehandlung vu PVDF ass et mat Methanol z'entdecken an ze aktivéieren, an dann zweemol mat destilléiert Waasser ze wäschen nodeems se grëndlech ofgedeckt sinn.Den Zweck fir Methanol Bubbles ze benotzen ass déi positiv gelueden Gruppen op der PVDF Membran ze aktivéieren an et méi einfach mat negativ gelueden Proteinen ze binden.
D'Leit benotzen et normalerweis fir 5-20 Minutten.Et kann gläichzäiteg wéi de Klebstoff geläscht ginn, an et gëtt geschat datt et ongeféier 5 Minutten dauert.Den Effekt ass net schlecht.An der Vergaangenheet hunn e puer Webfriends gepost datt d'Veraarbechtungszäit net vill wichteg ass, awer de Schlëssel war d'Qualitéit vum Film.Dat stëmmt.Soulaang d'Membran komplett gedämpft ass, sollt et OK sinn.
Dem Hybond seng PVDF Spezifizéierung liest wéi follegt: "Pre naass d'Membran an 100% Methanol (10 Sekonnen)".Mäi Verständnis ass datt et OK ass fir op d'mannst 10 Sekonnen ze drénken.Tatsächlech ass et OK fir 10 Sekonnen oder 10 Minutten ze drénken.
(2) Transfert
A. Lay déi ënnescht Filter Pabeier op der elektresch Transfermaart Instrument.Allgemeng ginn dräi Schichten benotzt.
B. D'Membran op d'Filterpabeier géint d'Membran leeën, oppassen datt Dir keng Blasen tëscht der Membran an dem Filterpabeier hutt, a gitt e puer Transferbuffer op d'Membran fir d'Membran naass ze halen.
C. De Klebstoff ofschielen, de Stackgel erofhuelen a virsiichteg op de Film réckelen.
D. Déi iewescht lénks Ecke vum Film ofschneiden an d'Kleimpositioun op de Film mat engem Bleistift markéieren.
E. Deckt e Stéck Filterpabeier géint de Klebstoff um Klebstoff.Gitt e puer Transferbuffer a leet zwee Stéck Filterpabeier.
F. Installéiert d'elektresch Transfert Instrument a wielt déi néideg aktuell an Zäit no de Besoinen.
G. Wärend dem Transfertprozess gëtt d'Spannungsännerung zu all Moment beobachtet, an all Anomalie gëtt an der Zäit ugepasst.
Post Zäit: Sep-07-2022
