剥離接着剤の使い方は？- パート1

剥離接着剤の使い方は？

ウェスタンブロット膜転写

電流の作用により、タンパク質はゲルから固体担体（膜）に移動します。

メンブレンの選択: インプリンティングで一般的に使用される固相材料には、NC メンブレン、DBM、DDT、ナイロンメンブレン、PVDF などが含まれます。当社では、タンパク質の吸着性、物理的強度、および化学的適合性に優れた PVDF (ポリフッ化ビニリデン) を選択します。イモビロン-p (0.45um) とイモビロン PSQ (MW < 20kDa の場合は 0.2um) の 2 つの仕様があります。

セミドライ製法

つまり、ゲル中間層の組み合わせは濾紙と転写緩衝液の間に配置され、電流は濾紙に吸着された緩衝液を通して伝導され、転写効果が達成されます。フィルム糊に電流が直接作用するため転写条件は比較的厳しいですが、転写時間が短く効率が高いです。

(1) 実験条件の選択

電流は1ma〜2ma / cm2で、通常は100mA /膜を使用します。転写時間は、ターゲットタンパク質分子の大きさやゲル濃度に応じて選択でき、実際の状況に応じて適切に調整できます。

ターゲットタンパク質の分子サイズ (kDa)、ゲル濃度、および転写時間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0.75

<20 15% 0.5

(2) 実験運用

(1) ろ紙とメンブレンの準備（準備は電気泳動の 20 分前に開始する）。

A. すぐには準備されない転送バッファが十分にあるかどうかを確認してください。

B. 適切なサイズのろ紙と膜があるかどうかを確認します。

C. 膜をメタノールに約 1 ～ 2 分間浸します。そして転送バッファに転送されます。

D. 適切な粘着濾紙と膜濾紙をそれぞれ転写バッファーに浸します。

トランスファーバッファーに入れるとき、PDVF メンブレンをメタノールにどれくらい浸す必要がありますか?

PVDF は疎水性であるため、転写バッファーに浸しにくいです。メタノール処理後は浸漬しやすくなります。PVDF の前処理は、メタノールに浸漬して活性化し、十分に浸した後、蒸留水で 2 回洗浄します。メタノール泡を使用する目的は、PVDF 膜上の正に帯電した基を活性化し、負に帯電したタンパク質と結合しやすくすることです。

通常、5〜20分間使用します。糊を取ると同時に浸すことも可能で、所要時間は5分程度が目安です。効果は悪くありません。以前、何人かのウェブフレンドが、処理時間はそれほど重要ではなく、重要なのはフィルムの品質であると投稿しました。それは本当だ。膜が完全に浸っていれば大丈夫です。

Hybond の PVDF 仕様には、「膜を 100% メタノールで事前に湿らせる (10 秒)」と記載されています。私の理解では、少なくとも10秒間浸しておけば大丈夫だと思います。実際は10秒でも10分でもOKです。

(2) 譲渡

A. 電気転写器の上に下濾紙を置きます。一般的には 3 つの層が使用されます。

B. メンブレンを濾紙の上にメンブレンに当てて置き、メンブレンと濾紙の間に気泡が入らないように注意し、メンブレンを湿った状態に保つためにトランスファーバッファーをメンブレン上に注ぎます。

C. 接着剤を剥がし、スタックジェルを取り外し、慎重にフィルム上に移動します。

D. フィルムの左上隅を切り取り、フィルム上の接着位置を鉛筆でマークします。

E. 接着剤の接着剤に対して濾紙をかぶせます。転写バッファーを注ぎ、ろ紙を 2 枚重ねます。

F. 電気伝達装置を設置し、必要に応じて必要な電流と時間を選択します。

G. 転写プロセス中、電圧の変化を常に観察し、異常があれば適時に調整する必要があります。