Jak používat separační lepidlo?- část 1

Jak používat separační lepidlo?

Přenos membrány Western blot

Působením proudu se protein přenese z gelu na pevný nosič (membránu).

Výběr membrány: mezi běžně používané materiály v pevné fázi při tisku patří NC membrána, DBM, DDT, nylonová membrána, PVDF atd. Vybíráme PVDF (polyvinylidenfluorid), který má lepší adsorpci bílkovin, fyzikální pevnost a lepší chemickou kompatibilitu.Existují dvě specifikace: immobilon-p (0,45um) a immobilon PSQ (0,2um pro MW < 20kDa).

Polosuchá metoda

To znamená, že kombinace gelové mezivrstvy je umístěna mezi filtrační papír s přenosovým pufrem a proud je veden přes pufr adsorbovaný na filtračním papíru, aby se dosáhlo přenosového účinku.Protože proud působí přímo na lepidlo fólie, jsou podmínky přenosu poměrně drsné, ale doba přenosu je krátká a účinnost je vysoká.

(1) výběr experimentálních podmínek

Proud je 1ma-2ma / cm2 a obvykle používáme 100 mA / membránu.Doba přenosu může být zvolena podle velikosti molekuly cílového proteinu a koncentrace gelu a může být vhodně upravena podle aktuální situace.

Velikost molekuly cílového proteinu (kDa), koncentrace gelu a doba přenosu

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12 % 0,75

<20 15 % 0,5

(2) experimentální provoz

(1) Příprava filtračního papíru a membrány (příprava se zahájí 20 minut před elektroforézou).

A. Zkontrolujte, zda je dostatek přenosových vyrovnávacích pamětí, které nejsou připraveny okamžitě.

B. Zkontrolujte, zda je filtrační papír a membrána správné velikosti.

C. Ponořte membránu do methanolu asi na 1-2 minuty.A poté přenesen do přenosové vyrovnávací paměti.

D. Namočte příslušný adhezivní filtrační papír a membránový filtrační papír do přenosového pufru.

Jak dlouho by se měla membrána PDVF nasáknout methanolem při vstupu do přenosového pufru?

PVDF je hydrofobní a je obtížné jej nasáknout do přenosového pufru.Po úpravě metanolem se snadněji namáčí.Předúprava PVDF je namočení a aktivace methanolem a poté dvakrát promytí destilovanou vodou po důkladném namočení.Účelem použití methanolových bublin je aktivace kladně nabitých skupin na membráně PVDF a usnadnění vazby s negativně nabitými proteiny.

Lidé jej obvykle používají po dobu 5-20 minut.Dá se namáčet současně s nabíráním lepidla a odhadem to zabere asi 5 minut.Efekt není špatný.V minulosti někteří weboví přátelé uváděli, že na době zpracování moc nezáleží, ale klíčová byla kvalita filmu.To je pravda.Dokud je membrána úplně promočená, mělo by to být OK.

Specifikace PVDF společnosti Hybond zní následovně: "předem zvlhčit membránu ve 100% methanolu (10 sekund)".Chápu to tak, že je v pořádku namočit alespoň 10 sekund.Ve skutečnosti je v pořádku namočit na 10 sekund nebo 10 minut.

(2) Převod

A. Položte spodní filtrační papír na elektrický přenosový přístroj.Obecně se používají tři vrstvy.

B. Položte membránu na filtrační papír proti membráně, dávejte pozor, aby mezi membránou a filtračním papírem nebyly bubliny, a nalijte na membránu trochu přenosového pufru, aby byla membrána vlhká.

C. Sloupněte lepidlo, vyjměte stohovací gel a opatrně jej přesuňte na fólii.

D. Odřízněte levý horní roh fólie a tužkou označte polohu lepidla na fólii.

E. Přikryjte kousek filtračního papíru proti lepidlu na lepidle.Nalijte trochu přenosového pufru a položte dva kusy filtračního papíru.

F. Nainstalujte elektrický přenosový přístroj a zvolte požadovaný proud a čas podle potřeb.

G. Během procesu přenosu musí být kdykoli pozorována změna napětí a jakákoliv abnormalita musí být včas upravena.