Як выкарыстоўваць раздзяляльны клей?- частка 1

Як выкарыстоўваць раздзяляльны клей?

Перанос мембраны Вестэрн-блот

Пад дзеяннем току бялок пераходзіць з геля на цвёрды носьбіт (мембрану).

Выбар мембраны: цвёрдафазныя матэрыялы, якія звычайна выкарыстоўваюцца ў імпрынтынгу, ўключаюць NC-мембрану, DBM, DDT, нейлонавыя мембраны, PVDF і г. д. Мы выбіраем PVDF (полівінілідэнфтарыд), які мае лепшую адсорбцыю бялку, фізічную трываласць і лепшую хімічную сумяшчальнасць.Ёсць дзве спецыфікацыі: иммобилон-р (0,45 мкм) і иммобилон PSQ (0,2 мкм для MW < 20 кДа).

Паўсухі спосаб

Гэта значыць, камбінацыя прамежкавага геля змяшчаецца паміж фільтравальнай паперай і буферам перадачы, і ток праходзіць праз буфер, адсарбаваны на фільтравальнай паперы, каб дасягнуць эфекту перадачы.Паколькі ток дзейнічае непасрэдна на плёнкавы клей, умовы перадачы адносна жорсткія, але час перадачы кароткі, а эфектыўнасць высокая.

(1) выбар умоў эксперыменту

Ток складае 1 ма-2 ма / см2, і мы звычайна выкарыстоўваем 100 мА / мембрану.Час перадачы можа быць выбраны ў залежнасці ад памеру малекулы мэтавага бялку і канцэнтрацыі геля, і можа быць скарэкціраваны адпаведным чынам у адпаведнасці з рэальнай сітуацыяй.

Малекулярны памер мэтавага бялку (кДа), канцэнтрацыя геля і час перадачы

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) эксперыментальная эксплуатацыя

(1) Падрыхтоўка фільтравальнай паперы і мембраны (падрыхтоўку пачынаюць за 20 хвілін да электрафарэзу).

А. Праверце, ці дастаткова буфераў перадачы, якія не падрыхтаваны адразу.

B. Праверце наяўнасць фільтравальнай паперы і мембраны патрэбнага памеру.

C. Апусціце мембрану ў метанол прыкладна на 1-2 хвіліны.А затым перадаецца ў буфер перадачы.

D. Намочыце адпаведную клейкую фільтравальную паперу і мембранную фільтравальную паперу адпаведна ў буфер для перадачы.

Як доўга мембрана PDVF павінна замочвацца ў метаноле пры ўваходзе ў буфер перадачы?

ПВДФ гідрафобны, і яго цяжка замачыць у буферы перадачы.Пасля апрацоўкі метанолам яго лягчэй замачыць.Папярэдняя апрацоўка PVDF заключаецца ў замочванні і актывацыі метанолам, а затым двойчы прамыванні дыстыляванай вадой пасля стараннага замочвання.Мэта выкарыстання бурбалак метанолу - актываваць станоўча зараджаныя групы на мембране PVDF і палегчыць звязванне з адмоўна зараджанымі вавёркамі.

Людзі звычайна выкарыстоўваюць яго на працягу 5-20 хвілін.Яе можна замочваць адначасова з прыёмам клею, і, паводле ацэнак, гэта зойме каля 5 хвілін.Эфект нядрэнны.У мінулым некаторыя вэб-сябры пісалі, што час апрацоўкі не мае вялікага значэння, але галоўнае - якасць фільма.Гэта праўда.Пакуль мембрана цалкам прамокла, усё павінна быць у парадку.

Спецыфікацыя Hybond PVDF абвяшчае наступнае: «папярэдне намочыце мембрану ў 100% метаноле (10 секунд)».Наколькі я разумею, можна замачыць не менш за 10 секунд.На самай справе можна замачыць на 10 секунд ці 10 хвілін.

(2) Перадача

А. Пакладзеце ніжнюю фільтравальную паперу на прыбор для электрычнага пераносу.Звычайна выкарыстоўваюць тры пласта.

B. Пакладзеце мембрану на фільтравальную паперу насупраць мембраны, звярніце ўвагу на тое, каб паміж мембранай і фільтравальнай паперай не было бурбалак, і наліце ​​на мембрану трохі буфера для перадачы, каб мембрана заставалася вільготнай.

C. Зніміце клей, выдаліце ​​гель і акуратна перамесціце яго на плёнку.

D. Адрэжце верхні левы кут плёнкі і адзначце алоўкам пазіцыю клею на плёнцы.

E. Накрыйце кавалак фільтравальнай паперы ад клею на клей.Наліце ​​трохі буфера для пераносу і пакладзеце два кавалкі фільтравальнай паперы.

F. Усталюйце прыбор электрычнага пераносу і выберыце неабходны ток і час у адпаведнасці з патрэбамі.

G. У працэсе перадачы змяненне напружання павінна назірацца ў любы час, і любыя адхіленні ад нормы павінны своечасова карэкціравацца.