Ajratish elimini qanday ishlatish kerak?- 1-qism

Ajratish elimini qanday ishlatish kerak?

Western blot membranasini uzatish

Oqim ta'sirida oqsil jeldan qattiq tashuvchiga (membranaga) o'tadi.

Membranani tanlash: nashr etishda tez-tez ishlatiladigan qattiq fazali materiallar bosimining ko'tarilishi membranasi, DBM, DDT, neylon membrana, PVDF va boshqalarni o'z ichiga oladi. Biz PVDF (poliviniliden ftorid) ni tanlaymiz, u yaxshiroq protein adsorbsiyasi, jismoniy kuch va kimyoviy muvofiqligi yaxshi.Ikkita spetsifikatsiya mavjud: immobilon-p (0,45um) va immobilon PSQ (MW < 20kDa uchun 0,2um).

Yarim quruq usul

Ya'ni, jel oraliq qatlamli birikmasi uzatish buferi bilan filtr qog'ozi orasiga joylashtiriladi va uzatish effektiga erishish uchun oqim filtr qog'oziga adsorbsiyalangan bufer orqali o'tkaziladi.Oqim to'g'ridan-to'g'ri plyonka elimiga ta'sir qilganligi sababli, uzatish shartlari nisbatan qattiq, ammo uzatish vaqti qisqa va samaradorlik yuqori.

(1) eksperimental sharoitlarni tanlash

Oqim 1ma-2ma / sm2 ni tashkil qiladi va biz odatda 100mA / membranani ishlatamiz.O'tkazish vaqti maqsadli oqsil molekulasining o'lchamiga va jel konsentratsiyasiga qarab tanlanishi mumkin va haqiqiy vaziyatga qarab mos ravishda sozlanishi mumkin.

Maqsadli protein molekulyar hajmi (kDa), jel konsentratsiyasi va uzatish vaqti

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) eksperimental operatsiya

(1) Filtr qog'ozi va membranani tayyorlash (tayyorlash elektroforezdan 20 daqiqa oldin boshlanishi kerak).

A. Etarli transfer buferlari bor yoki yo'qligini tekshiring, ular darhol tayyorlanmaydi.

B. Filtr qog'ozi va mos o'lchamdagi membrana mavjudligini tekshiring.

C. Metanolga membranani taxminan 1-2 daqiqaga botiring.Va keyin uzatish buferiga o'tkaziladi.

D. Tegishli yopishtiruvchi filtr qog'ozi va membrana filtr qog'ozini mos ravishda uzatish buferiga namlang.

Transfer tamponiga kirishda PDVF membranasi metanolda qancha vaqt singib ketishi kerak?

PVDF hidrofobik bo'lib, uni uzatish buferiga singdirish qiyin.Metanol bilan ishlov berilgandan so'ng, emdirish osonroq bo'ladi.PVDF ning dastlabki ishlovi uni metanol bilan namlash va faollashtirish, so'ngra yaxshilab namlangandan keyin distillangan suv bilan ikki marta yuvishdir.Metanol pufakchalarini ishlatishdan maqsad PVDF membranasidagi musbat zaryadlangan guruhlarni faollashtirish va manfiy zaryadlangan oqsillar bilan bog'lanishni osonlashtirishdir.

Odamlar odatda 5-20 daqiqa davomida foydalanadilar.Uni elim olish bilan bir vaqtda namlash mumkin va bu taxminan 5 daqiqa davom etishi taxmin qilinadi.Effekt yomon emas.Ilgari, ba'zi veb-do'stlar ishlov berish vaqti unchalik muhim emasligini, lekin asosiysi filmning sifati ekanligini e'lon qilishdi.Bu haqiqat.Membrana to'liq namlangan ekan, u yaxshi bo'lishi kerak.

Hybondning PVDF spetsifikatsiyasi quyidagicha: "membranani 100% metanolda (10 soniya) oldindan namlash".Tushundimki, kamida 10 soniya suvga cho‘msa bo‘ladi.Darhaqiqat, 10 soniya yoki 10 daqiqa davomida cho'milish yaxshidir.

(2) O'tkazish

A. Pastki filtr qog'ozini elektr uzatish moslamasiga qo'ying.Odatda uchta qatlam ishlatiladi.

B. Membranani filtr qog'oziga membranaga qarama-qarshi qo'ying, membrana va filtr qog'ozi o'rtasida pufakchalar bo'lmasligiga e'tibor bering va membranani nam saqlash uchun membranaga bir oz transfer buferini quying.

C. Yelimni yechib oling, stack jelini olib tashlang va ehtiyotkorlik bilan plyonkaga o'tkazing.

D. Filmning yuqori chap burchagini kesib oling va qalam bilan plyonkadagi elim o'rnini belgilang.

E. Filtr qog'ozini elim ustidagi elimga yoping.Bir oz transfer buferini to'kib tashlang va ikkita filtr qog'ozini qo'ying.

F. Elektr uzatish moslamasini o'rnating va ehtiyojlarga qarab kerakli oqim va vaqtni tanlang.

G. O'tkazish jarayonida kuchlanish o'zgarishi har qanday vaqtda kuzatilishi kerak va har qanday anormallik o'z vaqtida sozlanishi kerak.