Ayırma yapışqanını necə istifadə etmək olar?- 1-ci hissə

Ayırma yapışqanını necə istifadə etmək olar?

Western blot membran transferi

Cərəyanın təsiri altında zülal geldən bərk daşıyıcıya (membran) keçir.

Membran seçimi: çapda geniş istifadə olunan bərk fazalı materiallara NC membranı, DBM, DDT, neylon membran, PVDF və s. daxildir. Biz daha yaxşı protein adsorbsiyasına, fiziki gücə və daha yaxşı kimyəvi uyğunluğa malik olan PVDF (poliviniliden flüorid) seçirik.İki spesifikasiya var: immobilon-p (0.45um) və immobilon PSQ (MW < 20kDa üçün 0.2um).

Yarım quru üsul

Yəni, gel interlayer kombinasiyası transfer tamponu ilə filtr kağızı arasında yerləşdirilir və transfer effektinə nail olmaq üçün cərəyan filtr kağızına adsorbsiya edilmiş bufer vasitəsilə aparılır.Cərəyan film yapışqanına birbaşa təsir etdiyi üçün ötürmə şərtləri nisbətən sərtdir, lakin ötürmə müddəti qısadır və səmərəlilik yüksəkdir.

(1) eksperimental şəraitin seçilməsi

Cərəyan 1ma-2ma / sm2-dir və biz adətən 100mA / membran istifadə edirik.Köçürmə vaxtı hədəf protein molekulunun ölçüsünə və gel konsentrasiyasına görə seçilə bilər və faktiki vəziyyətə uyğun olaraq uyğunlaşdırıla bilər.

Hədəf protein molekulyar ölçüsü (kDa), gel konsentrasiyası və ötürülmə vaxtı

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1.5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) eksperimental əməliyyat

(1) Filtr kağızının və membranın hazırlanması (hazırlığa elektroforezdən 20 dəqiqə əvvəl başlanmalıdır).

A. Dərhal hazırlanmayan kifayət qədər transfer tamponlarının olub olmadığını yoxlayın.

B. Filtr kağızı və müvafiq ölçüdə membranın olub olmadığını yoxlayın.

C. Metanolda membranı təxminən 1-2 dəqiqə batırın.Və sonra transfer tamponuna köçürülür.

D. Müvafiq yapışan filtr kağızını və membran filtr kağızını müvafiq olaraq transfer tamponuna isladın.

Transfer tamponuna daxil olan zaman PDVF membranı metanolda nə qədər isladılmalıdır?

PVDF hidrofobikdir və transfer tamponunda islatmaq çətindir.Metanol müalicəsindən sonra onu islatmaq daha asandır.PVDF-nin ilkin müalicəsi onu metanol ilə islatmaq və aktivləşdirmək və hərtərəfli isladdıqdan sonra iki dəfə distillə edilmiş su ilə yumaqdır.Metanol qabarcıqlarından istifadənin məqsədi PVDF membranında müsbət yüklü qrupları aktivləşdirmək və mənfi yüklü zülallarla bağlanmağı asanlaşdırmaqdır.

İnsanlar adətən 5-20 dəqiqə istifadə edirlər.Yapışqan götürməklə eyni vaxtda islatmaq olar və bunun təxminən 5 dəqiqə çəkəcəyi təxmin edilir.Təsiri pis deyil.Keçmişdə bəzi internet dostları yazırdılar ki, emal vaxtının çox da əhəmiyyəti yoxdur, amma əsas olan filmin keyfiyyəti idi.Düzdür.Membran tamamilə isladıldığı müddətcə, OK olmalıdır.

Hybond-un PVDF spesifikasiyası aşağıdakı kimi oxunur: "membranı 100% metanolda (10 saniyə) əvvəlcədən nəmləndirin".Mən başa düşdüm ki, ən azı 10 saniyə islatmaq yaxşıdır.Əslində, 10 saniyə və ya 10 dəqiqə islatmaq yaxşıdır.

(2) Transfer

A. Aşağı filtr kağızını elektrik ötürmə alətinin üzərinə qoyun.Ümumiyyətlə üç qat istifadə olunur.

B. Membrananı filtr kağızının üzərinə membrana qarşı qoyun, membranla filtr kağızı arasında qabarcıqların olmamasına diqqət yetirin və membranı nəm saxlamaq üçün membranın üzərinə bir qədər transfer tamponu tökün.

C. Yapışqanı soyun, yığın gelini çıxarın və diqqətlə filmin üzərinə köçürün.

D. Filmin yuxarı sol küncünü kəsin və filmin üzərindəki yapışqan yerini qələmlə qeyd edin.

E. Yapışqan üzərindəki yapışqanın üstünə bir filtr kağızı bağlayın.Bir az transfer tamponu tökün və iki parça filtr kağızı qoyun.

F. Elektrik ötürmə alətini quraşdırın və ehtiyaclara uyğun olaraq tələb olunan cərəyanı və vaxtı seçin.

G. Ötürmə prosesi zamanı gərginliyin dəyişməsi istənilən vaxt müşahidə edilməli və hər hansı anormallıq vaxtında düzəldilməlidir.