Hvordan bruke separasjonslim?
Western blot-membranoverføring
Under påvirkning av strøm overføres proteinet fra gelen til den faste bæreren (membranen).
Membranvalg: de vanligste fastfasematerialene i imprinting inkluderer NC-membran, DBM, DDT, nylonmembran, PVDF, etc. Vi velger PVDF (polyvinylidenfluorid), som har bedre proteinadsorpsjon, fysisk styrke og bedre kjemisk kompatibilitet.Det er to spesifikasjoner: immobilon-p (0,45um) og immobilon PSQ (0,2um for MW < 20kDa).
En halvtørr metode
Det vil si at gel-mellomlagskombinasjonen plasseres mellom filterpapiret med overføringsbufferen, og strømmen ledes gjennom bufferen adsorbert på filterpapiret for å oppnå overføringseffekten.Fordi strømmen virker direkte på filmlimet, er overføringsforholdene relativt tøffe, men overføringstiden er kort og effektiviteten høy.
(1) utvalg av eksperimentelle forhold
Strømmen er 1ma-2ma / cm2, og vi bruker vanligvis 100mA / membran.Overføringstiden kan velges i henhold til størrelsen på målproteinmolekylet og gelkonsentrasjonen, og kan justeres hensiktsmessig i henhold til den faktiske situasjonen.
Målproteinmolekylstørrelse (kDa), gelkonsentrasjon og overføringstid
80---140 8 % 1,5-2,0
25---80 10 % 1,5
15—40 12 % 0,75
<20 15 % 0,5
(2) eksperimentell drift
(1) Klargjøring av filterpapir og membran (klargjøring skal startes 20 minutter før elektroforese).
A. Sjekk om det er nok overføringsbuffere, som ikke klargjøres umiddelbart.
B. Sjekk om det er filterpapir og membran av riktig størrelse.
C. Senk membranen i metanol i ca. 1-2 minutter.Og deretter overført til overføringsbufferen.
D. Bløtlegg egnet selvklebende filterpapir og membranfilterpapir i henholdsvis overføringsbufferen.
Hvor lenge skal PDVF-membranen trekke i metanol når den går inn i overføringsbufferen?
PVDF er hydrofob, og det er vanskelig å suge i overføringsbufferen.Etter metanolbehandling er det lettere å bløtlegge.Forbehandlingen av PVDF er å bløtlegge og aktivere den med metanol, og deretter vaske den to ganger med destillert vann etter grundig bløtlegging.Hensikten med å bruke metanolbobler er å aktivere de positivt ladede gruppene på PVDF-membranen og gjøre det lettere å binde seg med negativt ladede proteiner.
Folk bruker det vanligvis i 5-20 minutter.Det kan bløtlegges samtidig som du tar limet, og det er beregnet å ta ca 5 minutter.Effekten er ikke dårlig.Tidligere postet noen nettvenner at behandlingstiden ikke betydde så mye, men nøkkelen var kvaliteten på filmen.Det er sant.Så lenge membranen er helt gjennomvåt, skal den være OK.
Hybonds PVDF-spesifikasjon lyder som følger: "forfukt membranen i 100 % metanol (10 sekunder)".Min forståelse er at det er OK å bløtlegge i minst 10 sekunder.Faktisk er det OK å bløtlegge i 10 sekunder eller 10 minutter.
(2) Overføring
A. Legg det nedre filterpapiret på det elektriske overføringsinstrumentet.Vanligvis brukes tre lag.
B. Legg membranen på filterpapiret mot membranen, pass på at det ikke er bobler mellom membranen og filterpapiret, og hell litt overføringsbuffer på membranen for å holde membranen våt.
C. Skrell av limet, fjern stabelgelen og flytt den forsiktig over på filmen.
D. Klipp av øvre venstre hjørne av filmen og merk limposisjonen på filmen med en blyant.
E. Dekk et stykke filterpapir mot limet på limet.Hell litt overføringsbuffer og legg to stykker filterpapir.
F. Installer det elektriske overføringsinstrumentet og velg nødvendig strøm og tid i henhold til behovene.
G. Under overføringsprosessen skal spenningsendringen observeres til enhver tid, og enhver unormalitet skal justeres i tide.
Innleggstid: Sep-07-2022
