Com utilitzar la cola de separació?- part 1

Com utilitzar la cola de separació?

Transferència de membrana Western blot

Sota l'acció del corrent, la proteïna es transfereix del gel al transportador sòlid (membrana).

Selecció de membranes: els materials de fase sòlida més utilitzats en la impressió inclouen membrana NC, DBM, DDT, membrana de niló, PVDF, etc. Escollim PVDF (fluorur de polivinilidè), que té una millor adsorció de proteïnes, força física i millor compatibilitat química.Hi ha dues especificacions: immobilon-p (0,45um) i immobilon PSQ (0,2um per a MW <20kDa).

Un mètode semi sec

És a dir, la combinació entre capes de gel es col·loca entre el paper de filtre amb el tampó de transferència i el corrent es condueix a través del tampó adsorbit al paper de filtre per aconseguir l'efecte de transferència.Com que el corrent actua directament sobre la cola de la pel·lícula, les condicions de transferència són relativament dures, però el temps de transferència és curt i l'eficiència és alta.

(1) selecció de condicions experimentals

El corrent és 1ma-2ma/cm2, i normalment fem servir 100mA/membrana.El temps de transferència es pot seleccionar segons la mida de la molècula de proteïna objectiu i la concentració de gel, i es pot ajustar adequadament segons la situació real.

Mida molecular de la proteïna objectiu (kDa), concentració de gel i temps de transferència

80---140 8% 1,5-2,0

25---80 10% 1,5

15—40 12% 0,75

<20 15% 0,5

(2) operació experimental

(1) Preparació de paper de filtre i membrana (la preparació s'ha d'iniciar 20 minuts abans de l'electroforesi).

R. Comproveu si hi ha suficients buffers de transferència, que no es preparen immediatament.

B. Comproveu si hi ha paper de filtre i membrana de mida adequada.

C. Submergeix la membrana en metanol durant uns 1-2 minuts.I després es transfereix a la memòria intermèdia de transferència.

D. Remullar el paper de filtre adhesiu i el paper de filtre de membrana adequats al tampó de transferència respectivament.

Quant de temps ha de remull la membrana PDVF en metanol quan entra al tampó de transferència?

El PVDF és hidròfob i és difícil de submergir en el tampó de transferència.Després del tractament amb metanol, és més fàcil de remullar.El pretractament del PVDF és remullar-lo i activar-lo amb metanol, i després rentar-lo dues vegades amb aigua destil·lada després d'haver-lo remullat a fons.El propòsit de l'ús de bombolles de metanol és activar els grups carregats positivament a la membrana de PVDF i facilitar la unió amb proteïnes carregades negativament.

La gent normalment l'utilitza durant 5-20 minuts.Es pot remullar al mateix temps que agafar la cola, i es calcula que trigarà uns 5 minuts.L'efecte no és dolent.En el passat, alguns amics web van publicar que el temps de processament no importava gaire, però la clau era la qualitat de la pel·lícula.Això és cert.Mentre la membrana estigui completament remullada, hauria d'estar bé.

L'especificació de PVDF d'Hybond diu el següent: "pre mullar la membrana en 100% metanol (10 segons)".El que entenc és que està bé remullar durant almenys 10 segons.De fet, està bé remullar-se durant 10 segons o 10 minuts.

(2) Transferència

A. Col·loqueu el paper de filtre inferior a l'instrument de transferència elèctrica.Generalment s'utilitzen tres capes.

B. Col·loqueu la membrana sobre el paper de filtre contra la membrana, feu cas que no hi hagi bombolles entre la membrana i el paper de filtre i aboqueu una mica de tampó de transferència a la membrana per mantenir la membrana humida.

C. Traieu la cola, traieu el gel de pila i moveu-lo amb cura a la pel·lícula.

D. Talleu la cantonada superior esquerra de la pel·lícula i marqueu la posició de la cola a la pel·lícula amb un llapis.

E. Cobriu un tros de paper de filtre contra la cola de la cola.Aboqueu una mica de tampó de transferència i poseu dos trossos de paper de filtre.

F. Instal·leu l'instrument de transferència elèctrica i seleccioneu el corrent i el temps necessaris segons les necessitats.

G. Durant el procés de transferència, el canvi de tensió s'ha d'observar en qualsevol moment i qualsevol anormalitat s'ha d'ajustar a temps.